植酸含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5845

規格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入4mL試劑一，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

2、 試劑三：臨用前加入2.36mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入0.64mL濃硫酸，充分混合；2-8℃可以保存4周；

3、 試劑四：臨用前加入15mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入15μL濃硫酸，充分混合；2-8℃可以保存4周；

4、 工作液：臨用前根據樣本量按照試劑三：試劑四=1mL:5 mL(共6mL，40T)的比例混勻，配置后當天用完；

5、 標準品：臨用前加入1.08mL試劑一充分溶解，配制成10μmol/mL植酸標準品，2-8℃保存4周；

6、 250nmol/mL標準品的配制：臨用前取50μL 10μmol/mL植酸標準品和450μL蒸餾水混合為1μmol/mL標準品（即1000nmol/mL）；再取250μL 1000nmol/mL標準品和750μL蒸餾水混合配制成250nmol/mL植酸標準品，用于下述操作表標準管測定，現配現用。

產品說明：

植酸（Phytic acid），又名肌醇六磷酸、環己六醇六磷酸，普遍存在于真核細胞，在許多細胞活動中發揮關鍵作用，如：維持無機磷穩態、參與植物激素信號轉導、作為酶的輔助因子參與DNA修復、RNA編輯和mRNA輸出。植酸在植物發芽和生長過程中提供主要磷源，廣泛存在于谷類、豆類、水果、蔬菜和干果等植物性食物中。

在一定的環境條件下，植酸酶可以分解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）產生無機磷和肌醇衍生物，在酸性條件下，無機磷和鉬酸銨顯色劑發生反應，產生藍色的鉬藍物質，其在700nm有特征吸收峰，通過測定無機磷的含量，可計算出植酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、分析天平、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、濃硫酸（>98%，AR）、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 新鮮植物樣本：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，充分勻漿后，常溫震蕩2h，然后于4℃，10000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測。

2. 干粉類植物樣本：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~20的比例（建議稱取約0.05g，加入1mL提取液一）加入提取液一，充分勻漿后，常溫震蕩2h，然后于4℃，10000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測。

3. 液體樣本：取100μL液體加入1mL提取液一，常溫震蕩2h，然后于4℃，10000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產生大量氣泡，建議使用2 mL EP管進行操作。

二、測定步驟

1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至700nm，可見分光光度計蒸餾水調零。

2．操作表：（1.5mLEP管中加入下列試劑）

三、植酸含量計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

植酸含量（nmol/mg prot）= ΔA測定×C標÷ΔA標準×V樣÷(V樣×Cpr) =250×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

2. 按樣本質量計算

植酸含量（nmol/g 質量）= ΔA測定×C標÷ΔA標準×(V上清+V提取液二)÷(W×V上清÷V提取液一)

=296.875×ΔA測定÷ΔA標準÷W

3. 按液體體積計算

植酸含量（nmol/mL）=ΔA測定×C標÷ΔA標準×(V上清+V提取液二)÷[V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]

=3265.625×ΔA測定÷ΔA標準

C標：標準管濃度，250nmol/mL；V樣：加入樣本體積，0.12mL；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；V液體：液體樣本體積，0.1mL；W：樣本質量，g。

注意事項：

1、 如果?A測定小于0.010或測定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量后再進行測定；如果?A測定大于1，建議將樣本上清用蒸餾水適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

2、 如果樣本加入工作液后出現渾濁，建議將樣本上清用蒸餾水適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

3、 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取樣本。

實驗實例：

1. 稱取0.1044g洋蔥樣本，按照提取步驟和測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A對照=0.411-0.375=0.036，ΔA標準=A標準-A空白=0.811-0.096=0.715，按樣本質量計算得：

植酸含量（nmol/g 質量）=296.875×ΔA測定÷ΔA標準÷W=143.18nmol/g 質量。

2. 稱取0.05g小麥粉，按照提取步驟和測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A對照=0.331-0.188=0.143，ΔA標準=A標準-A空白=0.811-0.096=0.715，按樣本質量計算得：

植酸含量（nmol/g 質量）=296.875×ΔA測定÷ΔA標準÷W=1187.5nmol/g質量。

參考文獻：

[1] Senna R, Simonin V, Silva-Neto M A C, et al. Induction of acid phosphatase activity during germination of maize (Zea mays) seeds.[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2006, 44(7-9):467-473.

[2] Iqbal T H, Lewis K O, Cooper B T. Phytase activity in the human and rat small intestine[J]. Gut, 1994, 35(9):1233-1236.

[3] Azeke M A, Egielewa S J, Ihimire E. Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum)[J]. Journal of Food Science&Technology, 2011.

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