輔酶 I NAD (H)含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書 

微量法

貨號：BC5195

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 NAD標準品：臨用前加入 1.5 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

2、 NADH標準品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

產(chǎn)品說明：

輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式，在生物氧化中起傳遞氫的作用。氧化型輔酶I又稱煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脫氫酶的輔酶，它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會將脫下的氫遞給NAD，使之成為NADH（還原型輔酶I）。而NADH則會作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學滲透偶聯(lián)的方式，合成 ATP。NAD(H)在機體內(nèi)有重要的生理意義，與物質(zhì)代謝、能量代謝、抗細胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)。體內(nèi)輔酶I含量降低會導致細胞損傷或衰亡。

分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD⁺和NADH，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用WST-1檢測。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋，研缽/勻漿器、超聲破碎儀、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、血清（漿）中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

NADH的提取：建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5 mL堿性提取液，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

2、組織中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：建議取0.1g組織質(zhì)量，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

NADH的提取：建議取0.1 g組織質(zhì)量，加入0.5 mL堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

3、細胞或細菌中 NAD 和 NADH 的提取：

NAD⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，離心棄上清，建議500萬細胞或者細菌加入0.5mL酸性提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲3s，停10s，重復30次），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

NADH的提取：建議500萬細胞或者細菌加入0.5mL堿性提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲3s，停10s，重復30次），煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至450 nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 NAD⁺標準品：用蒸餾水稀釋為1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0nmol/mL的標準溶液，0nmol/mL即空白管。

3、 NADH標準品：用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0nmol/mL的標準溶液，0nmol/mL即空白管。

4、 稀釋表（附于說明書最后）

5、 在EP管中按順序加入下列試劑：

 混勻， 450nm下比色，讀取吸光值，NAD⁺的記為：ΔA_NAD= A₂- A₁，NADH的記為ΔA_NADH= A₂’- A₁’，NAD標準管的記為ΔA _NAD標= A_標-A空白管。NADH標準管的記為ΔA _NADH標= A_標’-A空白管。（標準曲線只需做1-2次，每個測定管需設一個對照管）

三、NAD⁺和NADH含量計算

1、標準曲線繪制：

（1） NAD⁺標準曲線的繪制：

根據(jù)標準管的濃度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y₁，ΔA標準），建立標準曲線。根據(jù)標準曲線，將ΔA測定代入方程得到x₁（nmol/mL）。

（2） NADH標準曲線的繪制

根據(jù)標準管的濃度（x₂，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y₂，ΔA標準），建立標準曲線。根據(jù)標準曲線，將ΔA′代入方程得到x₂（nmol/mL）。

2、NAD⁺和NADH含量計算

（一）NAD⁺含量計算

（1） 按液體體積計算：NAD⁺含量(nmol/mL）= x₁×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₁

（2） 按樣本蛋白濃度計算 NAD⁺ (nmol/mg prot）= x₁×V提取÷(V提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計算NAD⁺含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₁×V提取÷W= x₁÷W 

（4） 按細胞數(shù)量計算：NAD⁺含量(nmol/10⁴ cell）= x₁×V提取÷500=0.002×x₁

（二）NADH含量計算

（1） 按液體體積計算：NADH含量(nmol/mL）= x₂×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₂

（2） 按樣本蛋白濃度計算 NADH (nmol/mg prot）= x₂×V提取÷(V提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計算NADH含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₂×V提取÷W= x₂÷W 

（4） 按細胞數(shù)量計算：NADH含量(nmol/10⁴ cell）= x₂×V提取÷500=0.002×x₂

V提取：加入提取液體積，1mL；V血清：血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、反應過程中注意避光。

2、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。同步修改計算公式。

實驗實例：

1. NAD⁺的測定：稱取約 0.1g 冬青葉片，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.119-0.106=0.013，標準曲線y₁=0.373x+0.0012,根據(jù)標曲得出x₁=0.032，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.32 nmol/g 質(zhì)量。

NADH的測定：稱取約 0.1g 冬青葉片，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.172-0.128=0.044，標準曲線y₂=0.1479x,根據(jù)標曲得出x₂=0.297，NADH含量得：NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=2.97 nmol/g 質(zhì)量。

2. NAD⁺的測定：稱取約 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.119-0.105=0.014，標準曲線y₁=0.373x+0.0012,根據(jù)標曲得出x₁=0.034，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=3.4nmol/g 質(zhì)量。

NADH的測定：稱取約 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.145-0.112=0.033，標準曲線y₂=0.1479x,根據(jù)標曲得出x₂=0.223，NADH含量得：NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=2.23 nmol/g 質(zhì)量。

3. NAD⁺的測定：取0.1mL馬血清，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.114-0.097=0.017，標準曲線y₁=0.373x+0.0012,根據(jù)標曲得出x₁=0.042，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.42 nmol/g 質(zhì)量。

NADH的測定：取0.1mL馬血清，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.142-0.135=0.007，標準曲線y₂=0.1479x，根據(jù)標曲得出x₂=0.047，NADH含量得：NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=0.47 nmol/g 質(zhì)量。

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