異檸檬酸含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5955

規格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二工作液：臨用前先離心，根據樣本量按試劑二：蒸餾水=10μL：90μL（共100μL，約5T）的比例配制后使用，現配現用。

2、 試劑三：臨用前加入1.3 mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

3、 標準品：臨用前加入1 mL蒸餾水充分溶解成20μmol/mL異檸檬酸標準品。

4、 工作液：臨用前根據樣本量按試劑一：試劑二工作液：試劑三=150μL：20μL：10μL（共180μL，約1T）配成工作液后使用，現配現用。

產品說明：

異檸檬酸（Isocitric Acid）是檸檬酸的異構體，在許多水果和蔬菜以及由這些原料制成的食品中發現了大量的異檸檬酸鹽。生物能夠利用的是D型異檸檬酸，是三羧酸循環中的一個成分。

異檸檬酸在異檸檬酸脫氫酶（ICDH，EC1.1.1.41）的作用下變成a-酮戊二酸，同時NAD（P）還原為NAD（P）H，據此可以計算異檸檬酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔UV板、天平、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。（提取液二需緩慢加入，加入后會產生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。）

細菌或細胞：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5×10⁶個細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。（提取液二需緩慢加入，加入后會產生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。）

果汁等液體：取500μL液體樣本，加1mg粉劑一混勻后沸水浴5min（纏封口膜，防止爆蓋），靜置至室溫后于4℃ 12000g離心10min，取上清待測。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2、 工作液37℃預熱10min以上。

3、 標準品的稀釋：將20μmol/mL異檸檬酸標準品用蒸餾水進行稀釋得到12、10、8、4、2、1、0.5μmol/mL標準品備用。

4、 標準品稀釋表：

備注：下述實驗中每個標準管需20µL標準品（注意不要在此步驟直接檢測標準品吸光度）。

5、 樣本測定（在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列試劑）

三、異檸檬酸含量計算公式

1. 標準曲線的繪制

根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. 異檸檬酸含量計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

異檸檬酸含量（μmol/g prot）=x×V樣本÷（Cpr×V樣本）×F=x÷Cpr×F

（2）按樣本質量計算：

異檸檬酸含量（μmol/g 質量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×F=1.1875×x÷W×F

（3）按細菌或細胞數量計算：

    異檸檬酸含量（μmol/10⁶ cell）= x×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）×F=1.1875×x÷N×F

（4）按液體體積計算：

異檸檬酸含量（μmol/mL）=x×F

V樣本：加入的樣本體積，0.02mL；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細胞數量，以百萬計；F：稀釋倍數。

注意事項：

1.最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。

2.若樣本ΔA<0.005，可適當增大樣本量后測定；若樣本ΔA>1.0或A測定>1.5，可用蒸餾水稀釋上清液后測定，

注意同步修改計算公式中的稀釋倍數。

3.提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定，如需測定蛋白濃度，需另取組織。

實驗實例：

1、 取0.1139g蘋果加入提取液進行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（0.140-0.089）-（0.060-0.058）=0.049，帶入標曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，計算x=1.015，按樣本質量計算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/g 質量）=1.1875×x÷W×F=10.582 μmol/g 質量。

2、 取0.1033g橙子葉加入提取液進行冰浴勻漿，取上清用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（1.445-1.415）-（0.060-0.058）=0.028，帶入標曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，計算x=0.696，按樣本質量計算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/g 質量）=1.1875×x÷W×F=16.002 μmol/g 質量。

3、 取500μL橙汁飲料取上清后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（0.523-0.516）-（0.060-0.058）=0.005，帶入標曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，計算x=0.347，按樣本質量計算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/mL）=x×F=0.347 μmol/mL。

參考文獻：

[1] Kvasni Ka, Franti Ek, et al. "Determination of Isocitric Acid in Citrus Juice—A Comparison of HPLC, Enzyme Set and Capillary Isotachophoresis Methods." Journal of Food Composition & Analysis 15.6(2002):685-691.

[2] Kong, Min Jung, et al. "Mitochondrial NADP⁺-dependent isocitrate dehydrogenase deficiency increases cisplatin-induced oxidative damage in the kidney tubule cells." Cell Death & Disease 9.5(2018):488.

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