果糖激酶（FRK）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC5920

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：臨用前將粉劑一溶于提取液中；該試劑為懸濁液，使用前搖勻即可，2-8℃保存12周；

2. 試劑一：試劑放于試劑瓶內(nèi)玻璃管中。臨用前加入6mL蒸餾水，充分溶解，溶解后的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑二：試劑放于試劑瓶內(nèi)玻璃管中。臨用前加入6mL蒸餾水，充分溶解，溶解后的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

4. 試劑三：試劑放于試劑瓶內(nèi)玻璃瓶中，臨用前加入6mL蒸餾水溶解，溶解后的試劑2-8℃分裝保存4周；

5. 試劑五工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑五：蒸餾水=8μL: 1000μL（共1008μL，約20T）的比例配制，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

6. 試劑六：臨用前取一支試劑六加入1mL蒸餾水，充分溶解。溶解后的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。（該試劑為凍干試劑，可能存在不同瓶間肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用，實際質(zhì)量相同）

產(chǎn)品說明：

果糖激酶（Fructokinase，FRK，EC 2.7.1.4）是催化果糖磷酸化的主要酶。果糖激酶可以作為植物的己糖感受器和信號分子，通過影響植物的生長周期來調(diào)控植物的代謝和生長發(fā)育進(jìn)程，果糖磷酸化對于維持淀粉生物合成方向具有重要意義。

FRK催化果糖合成6-磷酸果糖，6-磷酸果糖在磷酸己糖異構(gòu)酶的作用下異構(gòu)為6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADH，NADH在340nm有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機(jī)、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿

器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：按樣本質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）=1 : 5~10比例加入提取液（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL提取液），冰浴勻漿后，于4℃，8000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 細(xì)胞樣本：按細(xì)胞數(shù)量（10⁶）：提取液體積（mL）=5~10 : 1的比例加入提取液（建議5百萬細(xì)胞加入1.0mL提取液），冰浴超聲破碎細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后于4℃，8000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

3. 液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。

二、 測定步驟

1．紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2．試劑四37℃預(yù)熱15min。

3．在1mL石英比色皿按下表順序加樣：

三、FRK活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：在37℃溫度下每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活單位。

FRK活性（U/mg prot）=ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：在37℃溫度下每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol的NADH定義為一個酶活單位。

FRK活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹÷(W÷V提取×V樣) ÷T =321.54×ΔA÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)目計算

單位的定義：在37℃溫度下每10⁶個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol的NADH定義為一個酶活單位。

FRK活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹÷(N÷V提取×V樣) ÷T =321.54×ΔA÷N

4. 按液體體積計算

單位的定義：在37℃溫度下每毫升每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol的NADH定義為一個酶活單位。

FRK活性（U/mL）=ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹÷V樣÷T =321.54×ΔA

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：1mL石英比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，1×10^-3L；10⁹：單位換算，1mol=10⁹nmol；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V提取：提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞數(shù)目，以10⁶計；T：反應(yīng)時間，5min。

注意事項：

1. 如果?A小于0.005，可以增加樣本量或延長反應(yīng)時間再進(jìn)行測定；如果?A測定大于0.6或A1測定小于A1空白，建議將樣本稀釋或者縮短反應(yīng)時間再進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 取0.1023g土豆組織樣本，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算：ΔA測定=A2測定-A1測定=0.165-0.092=0.073，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.013-0.012=0.001，ΔA=ΔA測定- ΔA空白=0.072。按樣本質(zhì)量計算得：

FRK活性（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W = 226.304 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.06g酵母粉，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算：ΔA測定=A2測定-A1測定=0.737-0.237=0.5，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.013-0.012=0.001，ΔA=ΔA測定- ΔA空白=0.499。按樣本質(zhì)量計算得：

FRK活性（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W =2674.141 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Giroix M H, Jijakli H, Courtois P, et al. Fructokinase activity in rat liver, ileum, parotid gland, pancreas, pancreatic islet, B and non-B islet cell homogenates.[J].International Journal of Molecular Medicine, 2006, 17(3):517-522.

[2] Kurt, Bergbauer, Ralf, et al. Studies on Fructose Metabolism in Cultured Astroglial Cells and Control Hepatocytes: Lack of Fructokinase Activity and Imrrunoreactivity in Astrocytes[J].Developmental Neuroscience, 2009, 18(5-6):371-379.

[3] Schaffer A A, Petreikov M. Inhibition of fructokinase and sucrose synthase by cytosolic levels of fructose in young tomato fruit undergoing transient starch synthesis[J].Physiologia Plantarum, 2010, 101(4):800-806.

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