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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC2410-50T/48S
更新時間：2024-07-08
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1546
010-50973130
產品分類
磷脂酶D（PLD）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2410
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6mL×1支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體70 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體45 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1．提取液二：試劑易揮發，用完后快速擰蓋，封口膜纏口；
2．試劑三：試劑放于試劑瓶內玻璃管中。臨用前取一支加入3mL乙醇充分溶解后取上清使用；2-8℃可以分裝保存2周，避免反復凍融；
3．標準品：50umol/mL 膽*溶液，臨用前用試劑一稀釋100倍即500nmol/mL標準溶液備用（可以取10μL 50umol/mL 膽*溶液加入990μL試劑一混勻即500nmol/mL標準溶液 ）。
產品說明：
磷脂酶D（Phospholipases D，PLD）催化水解磷脂酰膽*末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽*，膽*在膽*氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶的作用下將4-氨基安*比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質，在500nm處有特征吸收峰。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋、超速冷凍離心機、可調式移液槍、天平、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水、無水乙醇和冰。
操作步驟：一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、 組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例加入提取液，建議稱取約0.1g樣本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴勻漿后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
2、 細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
3、 血清（漿）：直接測定。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min 以上，調節波長到500nm，蒸餾水調零。
2、 樣本測定：
試劑名稱 (μL) | 空白管 | 標準管 | 測定管 |
試劑一 | 100 | - | - |
試劑二 | 150 | 150 | 150 |
標準品 | - | 100 | - |
樣 品 | - | - | 100 |
試劑三 | 100 | 100 | 100 |
充分混勻，30℃反應30min，沸水浴10min，打開蓋子，自然冷卻5min。 | |||
試劑四 | 700 | 700 | 700 |
30℃反應30min，測定500nm處吸光值，分別記為A空白管、A標準管和A測定管。計算ΔA標準= | |||
三、酶活計算
1、 按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽*產生1nmol膽*所需的酶量一個酶活力單位。
PLD活性 (U/mg prot) =ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷(Cpr×V提取)÷T = 16.7×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
2、 按樣本質量計算
酶活定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽*產生1nmol膽*所需的酶量一個酶活力單位
PLD活性 (U/g 質量) = ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷W÷T = 16.7×ΔA測定÷ΔA標準÷W
3、 按細菌或細胞數量計算
酶活定義：每104個細胞每分鐘水解磷脂酰膽*產生1nmol膽*所需的酶量一個酶活力單位。
PLD活性(U/104 cell）= ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷細胞數量÷T = 16.7×ΔA測定÷ΔA標準÷細胞數量
4、 按血清（漿）計算：
酶活定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽*產生1nmol膽*所需的酶量一個酶活力單位。
PLD活性（U/mL）= ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V血清（漿）÷V血清（漿）÷T = 16.7×ΔA測定÷ΔA標準
C標準：標準液濃度，500nmol/mL；V提?。杭尤氲奶崛∫后w積（提取液一+提取液二），1mL；V血清(漿)：血清(漿)體積，0.1mL；W：樣本質量，g；細胞數量：以萬計；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，30min。
注意事項：
1. 顯色完成后，若有沉淀，于8000g，25℃離心5min后取上清測定。
2. 吸光值不宜超過1，否則用試劑一將酶液進行稀釋，并在計算公式中乘以稀釋倍數。
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