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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC2420-50T/48S
更新時間：2024-07-08
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1340
010-50973130
產品分類
磷脂酶C（PLC）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2420
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6mL×1支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體35mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 提取液二：試劑易揮發，用完后快速擰蓋，封口封纏口。
2. 標準品：5μmol/mL對硝基苯*溶液。
3. 提取液的配制：臨用前根據樣本量將提取液一與提取液二1:1混合，切勿一次性全部混合，用多少配多少。
產品說明：
磷脂酶C（EC 3.1.4.3）是一種水解甘油磷酸酯C3位點甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶，廣泛存在于微生物及動植物的組織和細胞中，在細胞代謝、細胞傳遞、生長發育等方面具有重要作用。
磷脂酶C催化水解NPPC產生對硝基苯*，在410nm處有特征吸收峰。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋、超速冷凍離心機、可調式移液槍、天平、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、 組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例加入提取液，建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液，冰浴勻漿后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清再于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
2、 細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清再于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
3、 血清（漿）：直接測定。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min 以上，調節波長到410nm，蒸餾水調零。
2、 標準溶液的稀釋：將5μmol/mL對硝基苯*溶液用蒸餾水稀釋至0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.02、0.01μmol/mL。
3、 標準品稀釋表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） |
1 | 5 | 100 | 700 | 0.625 |
2 | 0.625 | 400 | 400 | 0.3125 |
3 | 0.3125 | 400 | 400 | 0.15625 |
4 | 0.15625 | 400 | 400 | 0.078 |
5 | 0.078 | 400 | 400 | 0.039 |
6 | 0.039 | 400 | 400 | 0.02 |
7 | 0.02 | 400 | 400 | 0.01 |
備注：實驗中每個標準管需100µL標準溶液。
4、 樣本測定：
試劑名稱 (μL) | 空白管 | 測定管 | 標準管 |
標準品 | - | - | 100 |
樣品 | - | 100 | - |
試劑一 | 100 | - | - |
試劑二 | 500 | 500 | 500 |
充分混勻，37℃反應30min | - | ||
試劑三 | 400 | 400 | 400 |
充分混勻，于1mL玻璃比色皿，測定410nm處吸光值，分別記為A空白、A測定和A標準，ΔA=A測定管-A空白管，ΔA標=A標準-A空白。標準曲線和空白管只需做1-2次。 | |||
三、酶活計算
1、 標準曲線：
以標準品濃度（x，μmol/mL）為橫坐標，吸光度ΔA標（y）為縱坐標建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA帶入公式中計算濃度x（μmol/mL）。
2、 酶活計算：
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性 (U/mg prot) = x×V樣÷(V樣×Cpr) ÷T = 0.033× x÷ Cpr
（2）按樣本質量計算
酶活定義：每克組織每分鐘水解NPPC產生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性 (U/g 質量) = x×V樣總÷W÷T = 0.033× x÷W
（3）按細菌或細胞數量計算
酶活定義：每104個細胞每分鐘水解NPPC產生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性(U/104 cell）= x×V樣總÷細胞數量÷T= 0.033× x÷細胞數量
（4）按血清（漿）體積計算：
酶活定義：每毫升血清每分鐘水解NPPC產生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性（U/mL）= x÷T = 0.033× x
V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：提取中加入的試劑一體積，1mL；W：樣本質量，g；細胞數量：以萬計；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，30min。
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