α-甘露糖苷酶(α-man)活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5045

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前每支加入0.5mL 試劑四溶解，溶解后的試劑在-20℃分裝保存，可以保存4周。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：5mmol/L的對硝基 苯*標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

α-man分布廣泛、種類繁多，在真核生物胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體中都有發(fā)現(xiàn)，不同種類、功能的α-man共同參與N-聚糖的修飾過程。

α-man和特定底物發(fā)生反應(yīng)，其生成物在405nm處有特征吸收峰，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出α-man活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、勻漿器/研缽、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后12000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。

2、細(xì)胞或細(xì)菌：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3 min）；然后15000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。

3、液體：直接檢測。若有渾濁可以離心后測定。

二、測定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至405 nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 將5mmol/L的對-硝基 苯*標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01 mmol/L

的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 操作表：(在1.5 mL離心管或者96孔板中)

三、α-甘露糖苷酶活性計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y＝kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mmol/L，即μmol/mL）。

2、 α-甘露糖苷酶活性的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μmol對-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T×F= x×0.1÷ Cpr×F

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol對-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/g質(zhì)量）=x×V樣÷（W÷V樣÷V提取）÷T×F= x×0.1÷W×F

（3）按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 μmol 對-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/10⁴ cell）= x×V樣÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V提取）÷T×F
= x×0.1÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）×F

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol對-硝 基苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/mL）＝x×V樣÷V樣÷T×F= x×0.1×F

V提取：提取液體積，1 mL；V樣：加入的樣本體積，0.025 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min； F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、如果測定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建議稀釋樣本后再測定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1 g兔子肝臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，12000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用96孔板按照測定步驟操作，計(jì)算ΔA=A測定管-A對照管=0.404-0.309=0.095，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037，計(jì)算x=0.0669，按公式計(jì)算活性：

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質(zhì)量）= x×0.1÷W×F = 0.0669 U/g質(zhì)量

2、 稱取0.1 g綠蘿葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，12000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用96孔板按照測定步驟操作，計(jì)算ΔA=A測定管-A對照管=0.179-0.159=0.02，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037，計(jì)算x=0.0119，按公式計(jì)算活性：

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質(zhì)量）= x×0.1÷W×F = 0.0119 U/g質(zhì)量

3、 用0.025mL牛血清按操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用96孔板按照測定步驟操作，計(jì)算ΔA=A測定管-A對照管=0.107- 0.086=0.021，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037，計(jì)算x=0.0127，按公式計(jì)算活性：

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 質(zhì)量）= x×0.1÷W×F = 0.0127 U/mL

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