ABTS自由基清除能力檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC477

規格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1、 試劑二：臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑可分裝后保存，-20℃可保存四周，避免反復凍融；

2、 試劑三工作液的配制：液體置于試劑瓶內EP管中。臨用前根據樣本量按試劑三（μL）：蒸餾水（mL）=1μL:12mL（注意單位）的比例配成試劑三工作液，現用現配，用多少配多少，盡量在4h之內用完；

3、 試劑四工作液的配制：可先將試劑四-20℃分裝保存。臨用前根據樣本量按試劑四：試劑一（V:V）=1:9的比例配成試劑四工作液，現配現用，用不完的試劑放于-20℃可保存兩周。

4、 試劑五：粉劑置于試劑瓶內玻璃瓶中，含有5 mg維生素C，臨用前加入2.8 mL提取液，充分振蕩溶解；配成10 mmol/L維生素C溶液，用于陽性對照。2-8℃可保存兩周。

5、 ABTS工作液的配制：臨用前根據試驗所需量按試劑一：試劑二：試劑三工作液（V:V:V）=76:5:4的比例配成ABTS工作液，現用現配，室溫避光保存，務必在30分鐘內使用。

產品說明：

ABTS法可用于親水性和親脂性物質抗氧化能力測定，是使用廣泛的間接檢測方法。ABTS經氧化后生成穩定的藍綠色陽離子ABTS自由基，在405 nm或734 nm處有最大吸收峰。被測物質加入ABTS自由基溶液后，所含抗氧化成分能與ABTS自由基發生反應而使反應體系褪色，405 nm的吸光度下降，在一定范圍內其吸光度的變化與自由基被清除的程度成正比。本試劑盒中，通過測定吸光度下降的程度來反映樣本清除ABTS自由基的能力。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、臺式離心機、研缽/粉碎機、烘干箱、30~50目篩、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、植物組織樣本的制備：將新鮮樣本置于60℃烘箱烘干至恒重，研缽研碎（或粉碎機粉碎），過30~50目篩；稱取約0.05 g樣本，加入1 mL提取液后置于40℃水浴鍋中浸提30 min；10000 rpm 室溫離心10 min，取上清，置于冰上待測。

2、紅酒、果汁等液體樣本：吸取100 μL樣本溶液加入900 μL提取液，旋渦振蕩混勻，室溫10000 rpm 離心10 min，取上清，置冰上待測。

3、提取物或者藥物：可用提取液配制成一定濃度，如5 mg/mL。

注意：不同樣本清除ABTS自由基的能力可能相差很大，為保證實驗結果的準確性，樣本要根據預實驗結果進行適當調整（如清除率大于90%，建議將提取的樣本用提取液進行稀釋；清除率小于5%，建議加大烘干樣本質量或液體樣本體積進行提取）。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長至405 nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2. 陽性對照的準備：若需要線性關系，建議將10 mmol/L的維生素C溶液用提取液配制成0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mmol/L的維生素C溶液待用，稀釋可參考下表；若需要清除率約為90%的陽性對照，則建議將10 mmol/L維生素C溶液用提取液配制成大于0.5 mmol/L的維生素C溶液待用。

備注：實驗中每個陽性對照管需10µL維生素C溶液。

3. 操作表：在96孔板或EP管中分別加入下列試劑：

三、ABTS自由基清除率的計算

1.  陽性對照的自由基清除率計算公式：

ABTS自由基清除率D_VC% =[(A空白-A陽性對照)÷A空白]×100%。

2.  樣本的自由基清除率計算公式：

ABTS自由基清除率D% =[A空白-(A測定-A對照)]÷A空白×100%。

注意事項：

1、不同樣本清除ABTS自由基的能力可能相差很大，如果要比較不同樣本的ABTS自由基清除能力，建議對于同一批樣本加入等量的樣本，紅酒、組織勻漿、果汁等液體樣本加入同樣體積，提取物（或者藥物）配制成同樣濃度。在比較時，將樣本根據預實驗結果進行適當調整，比較同樣濃度（相同稀釋倍數）的清除率大小。

2、樣本建議當天提取當天檢測。

實驗實例：

1、 取0.0502 g菠菜葉片加入1 mL提取液進行勻漿研磨，離心取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測定吸光值，計算清除率得：

D% =[A空白-(A測定-A對照)]÷A空白×100% =[0.69-(0.231-0.217)]÷0.69×100%=97.97%。

2、 取0.2 mmol/L VC陽性對照管按照測定步驟操作，使用96孔板測定吸光值，計算清除率得：

D_VC% =[(A空白-A陽性對照)÷A空白]×100% =[0.69-0.428]÷0.69×100%=37.97%。

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