α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC4765

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑一：臨用前取1支加入1.37 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑建議分裝后-20℃保存2周，避免反復(fù)凍融。

2、標(biāo)準(zhǔn)品：5 µmol/mL的對(duì)-硝基苯*溶液。

產(chǎn)品說明：

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase，α-L-Af）屬于糖基水解酶家族，可以從含有阿拉伯糖殘基的多聚物如阿拉伯木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非還原末端水解生成一個(gè)L-阿拉伯糖分子。該酶在半纖維素降解以及果實(shí)的成熟軟化過程中有著重要作用。

α-L-Af分解對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成對(duì)-硝基苯*，對(duì)-硝基苯*在400 nm處有最大吸收峰，通過測(cè)定400 nm處吸光值變化可計(jì)算得α-L-Af活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、超聲破碎儀、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織樣本的處理：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后15000 g，4℃，離心10 min，取上清（若為綠色植物的莖、葉、芽等組織，建議將上清用提取液稀釋5倍后檢測(cè)；若為果肉等組織，上清可直接檢測(cè)或根據(jù)預(yù)測(cè)定結(jié)果稀釋相應(yīng)倍數(shù)后檢測(cè)）置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞或細(xì)菌的處理：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3 min）；然后15000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、液體樣本的處理：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將5 µmol/mL的對(duì)-硝基苯*標(biāo)準(zhǔn)液用提取液稀釋為500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需60µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3、 操作表：(在1.5 mL離心管中)

三、α-L-Af活性計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（y，ΔA測(cè)定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，nmol/mL）。

2、 α-L-Af活性的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1 nmol對(duì)-硝基苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-L-Af酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=2x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g樣本每小時(shí)產(chǎn)生1 nmol對(duì)-硝基苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-L-Af酶活（U/g質(zhì)量）=x×V提取÷W÷T=2x÷W

（3）按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生1 nmol對(duì)-硝基苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-L-Af酶活（U/10⁴ cell）=x×V提取÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷T=2x÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每小時(shí)產(chǎn)生1 nmol對(duì)-硝基苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-L-Af酶活（U/mL）＝x×V樣÷V樣÷T＝2x

V提取：提取液體積，1 mL；V樣：加入的樣本體積，0.06 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min。

注意事項(xiàng)：

1、 A或ΔA大于1.2時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

2、 正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定，若濃度過高，建議將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)；若濃度過低，建議在樣本提取時(shí)增加組織質(zhì)量。

3、 加入試劑二后，建議5 min內(nèi)讀取OD值。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g黑麥穗進(jìn)行樣本處理，取上清稀釋2倍后，按測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.642-0.276=0.366，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0024x-0.0045，計(jì)算x=154.375，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

α-L-Af酶活（U/g 質(zhì)量）=2x÷W×2（稀釋倍數(shù)）=2×154.375÷0.1×2（稀釋倍數(shù)）=6175 U/g 質(zhì)量。

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