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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5380-50T/24S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1003
010-50973130
產品分類
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吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5380
規格：50T/24S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體300μL×1支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體15mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體8mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 提取液二：易揮發試劑，用完后盡快封口放回-20℃保存。
2、 提取液的配制：根據樣本量按提取液一：提取液二=0.99mL：0.01mL（1T）的比例配制提取液，現用現配，禁止提前配制。
3、 試劑三：臨用前加入14mL試劑一，充分混勻。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融。
4、 標準品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL NADH標準液，未用完的試劑分裝保存，-20℃可以保存2周，避免反復凍融。臨用前取50μL的2 µmol/mL NADH標準液于EP管中，加入750μL蒸餾水充分溶解，配制成0.125μmol/mL的NADH標準溶液待用，現用現配。
產品說明：
吡咯啉-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)是廣泛存在于原核和真核生物中的一種重要的管家蛋白。在NAD(P)H的作用下，吡咯啉-5-羧酸(P5C)在吡咯啉-5-羧酸還原酶作用下轉化為脯*酸，并且P5CR 還被發現能夠在大腸桿菌中參與到硫代脯*酸(Thioproline) 的代謝過程。
硫代脯*酸在吡咯啉-5-羧酸還原酶催化作用下脫氫，并伴隨著NAD轉化為NADH。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應，產生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、分析天平、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、1mL玻璃比色皿、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）等液體：直接測定。(若溶液呈現渾濁，則離心取上清后再測定)。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至450nm，蒸餾水調零。
2、操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
試劑二 | 450 | 450 | 450 | 450 |
試劑三 | 450 | - | - | - |
蒸餾水 | - | 450 | 450 | 550 |
試劑四 | 100 | 100 | 100 | 100 |
標準溶液 | - | - | 100 | - |
樣品 | 100 | 100 | - | - |
充分混勻，37℃反應顯色30min，取1000μL于1mL玻璃比色皿中，測定在450nm處的吸光度。記作A測定，A對照，A標準，A空白。?A測定=A測定-A對照，?A標準=A標準-A空白。（標準管和空白管只需做1-2次。） | ||||
三、P5CR活性計算
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
P5CR活性（U/mg prot）=(?A測定×C標準÷?A標準) ×V樣 ÷（Cpr×V樣）÷T×103×F=4.167×?測定÷?標準÷Cpr×F
(2) 按樣本質量計算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
P5CR活性（U/g 質量）= (?A測定×C標準÷?A標準) ×V樣 ÷（W÷V樣總×V樣）÷T×103×F=4.167×?測定÷?標準÷W×F
(3) 按細菌或細胞數目計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
P5CR活性（U/104 cell）= (?A測定×C標準÷?A標準) ×V樣 ÷（500÷V樣總×V樣）÷T×103×F=0.0083×?測定÷?標準×F
(4) 按血清（漿）等液體體積計算
單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
P5CR活性（U/mL）= (?A測定×C標準÷?A標準) ×V樣÷V樣÷T×103×F=4.167×?測定÷?標準×F
C標準: NADH標準液的濃度，0.125μmol/mL；V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.1mL；V樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應時間，30min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；
500：細胞或細菌數目，500萬；103：單位換算系數，1μmol/mL=103nmol/mL；F：樣本稀釋倍數。
注意事項：
1. 如果A測定大于1.5或者?A測定大于0.8，可以減少樣品量或者縮短反應時間；若?A測定小于0.01，可以加大樣品量或者延長反應時間至1h或者更長時間。計算公式注意同步修改
實驗實例：
1、 稱取0.0993g橙子葉片，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A測定-A對照=0.413-0.324=0.089，?A標準=A標準- A空白=0.609-0.363=0.246，帶入公式計算：
P5CR活性(U/g 質量)= 4.167×?測定÷?標準÷W×F =4.167×0.089÷0.246÷0.0993=15.182 U/g
2、 稱取0.1006g小鼠腎臟組織，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A測定-A對照=0.543-0.461=0.082，?A標準=A標準- A空白=0.609-0.363=0.246，帶入公式計算：
P5CR活性(U/g 質量)= 4.167×?測定÷?標準÷W×F =4.167×0.082÷0.246÷1.006=13.807U/g
3、 吸取0.02mL羊血清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A測定-A對照=0.616-0.215=0.401，?A標準=A標準- A空白=0.609-0.363=0.246，帶入公式計算：
P5CR活性(U/mL)= 4.167×?測定÷?標準×F =4.167×0.401÷0.246=6.793U/mL
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