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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5370-50T/24S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：935
010-50973130
產品分類
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土壤植酸酶活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC5370
規格：50T/24S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體2.5 mL×1瓶（自備） | 2-8℃保存 |
試劑二A | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二B | 液體50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 試劑一：甲苯，需自備。
2. 試劑二：臨用前將試劑二B全部倒入試劑二A中，充分震蕩溶解，用不完的試劑2-8℃可保存4周。
3. 試劑三：臨用前加入7mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入1.89mL濃硫酸，用不完的試劑2-8℃可保存4周。
4. 試劑四：臨用前加入35mL蒸餾水充分溶解，再加入50μL濃硫酸，用不完的試劑2-8℃可保存4周。
5. 工作液：臨用前根據測定數量將試劑三：試劑四=1mL：5mL（約12T，可根據樣本量按比例調整）的比例混勻，配制后于2-8℃可保存3天。
6. 標準品：10 μmol/mL無機磷標準液。
產品說明：
植酸酶（Phytase）又叫肌醇六磷酸酶，是一種蛋白質和糖的結合酶，植酸酶可以分解植酸產生無機磷和肌醇，極大的提高生物對養分的利用率。土壤植酸酶主要來自于土壤中的微生物，在磷素循環中起著重要作用，土壤植酸酶在土壤改良和農業可持續發展領域具有較強的應用前景。
在一定的環境條件下，土壤植酸酶可以分解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）產生無機磷和肌醇衍生物，在酸性條件下，無機磷和鉬酸銨顯色劑發生反應，產生藍色的鉬藍物質，其在700nm有特征吸收峰，通過測定無機磷的含量，可計算出土壤植酸酶的活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、研缽、30-50目篩、甲苯、濃硫酸、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
新鮮土樣自然風干或 37℃烘箱風干，過 30~50 目篩。
二、測定步驟
1、可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至700nm，用蒸餾水調零。
2、標準溶液的稀釋：將10μmol/mL無機磷標準液用蒸餾水稀釋至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、0.039、0.02、0.01、0.005μmol/mL備用。
3、標準溶液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） |
1 | 10 | 200 | 1400 | 1.25 |
2 | 1.25 | 700 | 700 | 0.625 |
3 | 0.625 | 700 | 700 | 0.3125 |
4 | 0.3125 | 700 | 700 | 0.15625 |
5 | 0.15625 | 700 | 700 | 0.078125 |
6 | 0.078125 | 700 | 700 | 0.039 |
7 | 0.039 | 700 | 700 | 0.02 |
8 | 0.02 | 700 | 700 | 0.01 |
9 | 0.01 | 700 | 700 | 0.005 |
備注：實驗中每個標準管需500µL標準溶液。
4、在EP管中按下表步驟加樣：
試劑名稱 | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
土樣(g) | 0.05 | 0.05 | - | - |
試劑一(μL) | 35 | 35 | - | - |
振蕩，用試劑一將土樣浸濕（潮濕狀態即可），室溫放置15min | - | - | ||
試劑二(μL) | 835 | - | - | - |
混勻，37℃水浴/恒溫培養24h，沸水浴10min | - | - | ||
試劑二(μL) | - | 835 | - | - |
10000g，25℃離心5min，取上清 | - | - | ||
標準液(μL) | - | - | 500 | - |
蒸餾水(μL) | - | - | - | 500 |
上清液(μL) | 500 | 500 | - | - |
工作液(μL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
常溫靜置15min，于700nm處測定吸光值，分別記為A測定、A對照、A標準、A空白。分別計算 ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標準=A標準-A空白（標準曲線和空白管只需做 1-2 次，每個測定管需設置一個對照管）。
三、土壤植酸酶活性的計算
1. 標準曲線的繪制
根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）代入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。
2. 土壤植酸酶活性計算
單位定義：37℃下每g土壤每天在反應體系釋放1μmol無機磷為1個酶活力單位。
土壤植酸酶活性（U/g）= x×V反總÷W÷T=0.87x÷W
V反：反應體系總體積，0.87mL；W：土壤質量，g；T：反應時間，24h=1d。
注意事項：
1. 為防止沸水浴10min過程中水分散失，建議使用螺旋蓋的離心管或用封口膜給EP管纏口。
2. 如果ΔA測定< 0.01，適當延長第一步37℃反應時間或加大樣本量后，重新測定。如果ΔA測定＞1.2，建議將上清液用蒸餾水適當稀釋后進行測定，注意乘以稀釋倍數。
3. 結果于30min內測定完畢，盡量保證所有樣本測定時間的一致性。
實驗實例：
1. 取0.05g林土，按照測定步驟操作，在玻璃比色皿中測得A測定 = 1.187，A對照 = 0.776，?A測定= 0.411，將?A測定代入標曲公式y = 1.7046x + 0.0063，得出x= 0.2374，按樣本質量計算酶活得：
土壤植酸酶活性（U/g）= 4.13U/g。
2. 取0.05g蘑菇地土壤，按照測定步驟操作，測得A測定 = 0.756，A對照 = 0.577，?A測定= 0.179，將?A測定代入標曲公式y = 1.7046x + 0.0063，得出x= 0.1013，按樣本質量計算酶活得：
土壤植酸酶活性（U/g）= 1.763 U/g。
參考文獻：
[1] Berry D F, Shang C, Zelazny L W. Measurement of phytase activity in soil using a chromophoric tethered phytic acid probe[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2009, 41(2):192-200.
[2] Marshall, Arebojie, Azeke, et al. Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum) [J]. Journal of Food Science&Technology, 2011, 48(6):724-729.
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