土壤碳酸酐酶（S-CA）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5505

規格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支試劑二，先加入650μL丙酮使粉劑充分溶解，再加入6.7mL蒸餾水。未用完的試劑分裝保存，-20℃可以分裝保存1周，避免反復凍融。

2、 標準品：5μmol/mL 酚標準液。臨用前取50μL的5μmol/mL 酚標準液于中，加入750μL蒸餾水充分混合，配置成0.3125 μmol/mL的酚標準液。

產品說明：

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA, EC4.2.1.1）是一種以Zn²⁺為活性中心的金屬酶，可用來高效催化CO₂的可逆水合反應：CO₂+H₂0?HCO₃^-+H⁺，催化速率可達自然條件下的10⁷倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。

碳酸酐酶可催化乙酸對硝基苯酯反應生成對硝基苯*，通過檢測405nm處吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養箱、30-50目篩、研缽、分析天平、臺式離心機、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、甲苯、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

新鮮土樣自然風干或37℃烘箱風干，過 30~50目篩。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至405nm，可見分光光度計用蒸餾水調零。

2、 試劑一使用前37℃預熱15min。

3、 標準管測定

（1） 標準管測定：在1.5mL EP管內中加入80μL標準液，320μL試劑一，充分混勻后，吸取0.2mL于微量玻璃比色皿/96孔板中測定405nm處吸光值，記作A_標準。

（2） 標準空白管測定：在1.5mL EP管內中加入80μL蒸餾水，320μL試劑一，充分混勻后，吸取0.2mL于微量玻璃比色皿/96孔板中測定405nm處吸光值，記作A_標準空白。

（3） 計算?A_標準=A_標準-A_標準空白。（標準管和標準空白管只需做1-2次。）

4、 操作表：（在1.5mLEP管內加入）

三、土壤CA活性計算

按樣本質量計算

單位的定義：37℃，每g組織每分鐘催化產生1μmol 對硝基苯*定義為一個酶活力單位。

S-CA活性（U/g 質量）= C_標×?A÷?A_標準×V_標準÷W÷T×F=0.005×?A÷?A_標準÷W×F

C_標：標準品濃度，0.3125μmol/mL；V_標準：反應體系中加入的標準液體積，0.08mL；T：反應時間，5min； W：樣本質量，g； F：樣本稀釋倍數。

注意事項：

1、 如果A_測定大于1.5或者?A大于0.8，可以減少樣本量或者縮短37℃酶促反應時間；?A小于0.02，可以加大樣本量或者延長37℃酶促反應時間。注意計算時同步修改計算公式。

2、 如果離心后待測的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉速或延長時間，例如20000g，4℃，離心10min。

實驗實例：

1、 稱取0.1016g土壤樣本16號，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A =A_測定-A_對照=0.353-0.227=0.126，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.65-0.046=0.604，帶入公式計算：

S-CA活性（U/g 質量）=0.005×?A÷?A_標準÷W×F =0.010 U/g 質量

2、 稱取0.1056g土壤樣本62號，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A =A_測定-A_對照=0.577-0.271=0.306，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.65-0.046=0.604，帶入公式計算：

S-CA活性（U/g 質量）=0.005×?A÷?A_標準÷W×F =0.024 U/g 質量

參考文獻：

[1] Li W ,Yu L J , Yuan D X , et al. A study of the activity and ecological significance of carbonic anhydrase from soil and its microbes from different karst ecosystems of Southwest China[J]. Plant and Soil, 2005, 272(1):133-141.

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