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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5500-50T/24S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1115
010-50973130
產品分類
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土壤碳酸酐酶（S-CA）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5500
規格：50T/24S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體75mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前取一支試劑二，先加入1mL丙酮使粉劑充分溶解，再加入10mL蒸餾水。未用完的試劑分裝保存，-20℃可以分裝保存1周，避免反復凍融。
2、 標準品：5μmol/mL 酚標準液。臨用前取50μL的5μmol/mL 酚標準液于試劑瓶中，加入750μL蒸餾水充分混合，配置成0.3125 μmol/mL的酚標準液。
產品說明：
碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA, EC4.2.1.1）是一種以 Zn2+為活性中心的金屬酶，可用來高效催化 CO2 的可逆水合反應：CO2+H20?HCO3-+H+，催化速率可達自然條件下的107倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。
碳酸酐酶可催化乙酸對硝基苯酯反應生成對硝基苯*，通過檢測405nm處吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋/恒溫培養箱、30-50目篩、研缽、分析天平、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、甲苯、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
新鮮土樣自然風干或 37℃烘箱風干，過 30~50目篩。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至405nm，蒸餾水調零。
2、 試劑一使用前37℃預熱15min。
3、 標準管測定
（1） 標準管測定：在2mL EP管內中加入320μL標準液，1180μL試劑一，充分混勻后，于1mL玻璃比色皿中測定405nm處吸光值，記作A標準。
（2） 標準空白管測定：在2mL EP管內中加入320μL蒸餾水，1180μL試劑一，充分混勻后，于1mL玻璃比色皿中測定405nm處吸光值，記作A標準空白。
（3） 計算?A標準=A標準-A標準空白。（標準管和標準空白管只需做1-2次。）
4、 操作表：（在2mLEP管內加入）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 0.2g | 0.2g |
甲苯 | 50 | 50 |
充分振蕩使土壤呈潮濕狀態，常溫靜置15min | ||
試劑一 | 1130 | 1130 |
- | - | 煮沸10min，冰水冷卻 |
試劑二 | 320 | 320 |
37℃反應5min后立即放入冰水浴中，之后15000g，4℃離心10min。吸取上清于1mL玻璃比色皿中測定405nm處吸光值，記作A測定，A對照。計算?A =A測定-A對照。（每個測定管對應一個對照管） | ||
三、土壤CA活性計算
按樣本質量計算
單位的定義：37℃，每g土壤每分鐘催化產生1μmol 對硝基苯*定義為一個酶活力單位。
S-CA活性（U/g 質量）=C標×?A÷?A標準×V標準÷W÷T×F=0.02×?A÷?A標準÷W×F
C標：標準品濃度，0.3125μmol/mL；V標準：反應體系中加入的標準液體積，0.32mL；T：反應時間，5min； W：樣本質量，g；F：樣本稀釋倍數。
注意事項：
1、 如果A測定大于1.5或者?A大于0.8，可以減少樣本量或者縮短37℃酶促反應時間；?A小于0.02，可以加大樣本量或者延長37℃酶促反應時間。注意計算時同步修改計算公式。
2、 如果離心后待測的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉速或延長時間，例如20000g，4℃離心10min。
實驗實例：
1、 稱取0.2014g土壤樣本65號，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A =A測定-A對照=0.595-0.400=0.195，?A標準=A標準-A標準空白=0.448-0=0.448，帶入公式計算：
S-CA活性（U/g 質量）=0.02×?A÷?A標準÷W×F =0.043 U/g 質量
2、 稱取0.2015g土壤樣本1號，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A =A測定-A對照=0.275-0.137=0.138，?A標準=A標準-A標準空白=0.448-0=0.448，帶入公式計算：
S-CA活性（U/g 質量）=0.02×?A÷?A標準÷W×F =0.031 U/g 質量
參考文獻：
[1] Li W, Yu L J, Yuan D X, et al. A study of the activity and ecological significance of carbonic anhydrase from soil and its microbes from different karst ecosystems of Southwest China[J]. Plant and Soil, 2005, 272(1):133-141.
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