土壤丙酮酸（S-PA）含量檢測試劑盒（酶法）說明書

                                               微量法

貨號：BC5535

規格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入3.6mL蒸餾水充分溶解，分裝保存，-20℃可以保存4周，避免反復凍融。

2、 試劑三：臨用前按試劑三：蒸餾水=1μL：100μL（共101μL，約6T）的比例進行稀釋，現用現配。

3、 標準品：20μmol/mL丙酮酸鈉標準液。

產品說明：

丙酮酸通過乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。

在pH=7.5時，丙酮酸在LDH的催化作用下與NADH反應，生成NAD ⁺和乳酸。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應，產生水溶性Formazan。通過檢測450nm條件下吸光值，可以計算出丙酮酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液槍、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽、超聲清洗儀、30-50目篩和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

新鮮土樣自然風干或37℃烘箱風干，過30~50目篩。

稱取風干混勻土樣約0.1g，加入1mL蒸餾水混勻；然后置于超聲清洗儀常溫超聲30min。然后12000g，常溫離心10min，取上清液待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長到450nm，蒸餾水調零。

2、 試劑一37℃至少預熱20min。

3、 標準品的制備：將20μmol/mL丙酮酸鈉標準液用蒸餾水稀釋得到0.625、0.5、0.3125、0.25、0.15625、0.125μmol/mL標準溶液備用。

4、 標準品稀釋表：

實驗中每個標準管需20µL標準溶液。

5、 操作表：

三、土壤丙酮酸含量計算

1、標準曲線繪制：

根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA_標準（y，ΔA_標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA_測定代入方程得到x（μmol/mL）。

2、土壤丙酮酸含量計算：

土壤丙酮酸含量（μmol/g 質量）= x×V樣÷(V樣÷V提×W) = x÷W

V樣：加入的樣本體積，0.02mL；V提：前處理中加入蒸餾水的體積，1mL；W：樣本質量，g。

注意事項：

1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用蒸餾水稀釋樣本后再進行測定。

實驗實例：

1、 稱取約0.103g花盆土樣，加入1mL蒸餾水，超聲破碎30min，10000g，常溫離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定=（A_空白1- A_空白2）-（A_測定-A_對照）=（0.601-0.048）-（0.455-0.067）=0.165，標曲y=0.8017x-0.0471，R²=0.9985，x=0.265µmol/mL, 計算土壤丙酮酸含量得： 

土壤丙酮酸含量（µmol/g 質量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =2.573µmol/g 質量。

2、 稱取約0.101g污泥，加入1mL蒸餾水，超聲破碎30min，10000g，常溫離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定=（A_空白1- A_空白2）-（A_測定-A_對照）=（0.601-0.048）-（0.331-0.07）=0.292，標曲y=0.8017x-0.0471，R²=0.9983，x=0.423µmol/mL, 計算土壤丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 質量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =4.188µmol/g 質量。

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