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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5590-50T/48S
更新時間：2024-04-22
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1102
010-50973130
產品分類
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游離血紅蛋白（FHb）含量檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5590
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體40mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體40mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體2mL×1支 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 工作液：臨用前根據樣本量按照試劑一：試劑二：試劑三=500μL：500μL：25μL（1.025mL，約1T）的比例配制工作液，現用現配。
2. 標準品：5mg血紅蛋白，臨用前加入1mL蒸餾水，充分混勻，配制成5mg/mL標準液，2-8℃可保存4周。
產品說明：
血管內發生溶血時，紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白，血漿中游離血紅蛋白（free hemoglobin，FHb）增多。自身免疫性溶血性貧血、鐮刀型細胞貧血、珠蛋白生成障礙性貧血患者血漿FHb有輕度至中度增加，陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥、陣發性嚴寒性血紅蛋白尿癥、不穩定血紅蛋白病等會出現血尿癥狀。因此，血漿中FHb的測定對于臨床診斷溶血性疾病有重要作用。
血紅蛋白中的亞鐵血紅素有類似過氧化物酶的催化活性，能夠催化過氧化氫氧化4-氨基安*比林和苯胺類似物，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰，其顏色深淺與FHb含量成正比。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理
血漿等液體：直接測定。若有渾濁請離心后取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至546nm，蒸餾水調零。
2、 標準溶液的稀釋：將5mg/mL（5000mg/L）血紅蛋白標準液用蒸餾水進行稀釋得到156.25、78.125、39.063、19.531、9.766、4.883mg/L的標準溶液備用。
3、 標準溶液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（mg/L） | 標準溶液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（mg/L） |
1 | 5000 | 25 | 775 | 156.25 |
2 | 156.25 | 100 | 100 | 78.125 |
3 | 78.125 | 100 | 100 | 39.063 |
4 | 39.063 | 100 | 100 | 19.531 |
5 | 19.531 | 100 | 100 | 9.766 |
6 | 9.766 | 100 | 100 | 4.883 |
備注：實驗中每個標準管需60µL標準溶液。
4、 將工作液37℃預熱15min。
5、 在1mL玻璃比色皿中按下表步驟加樣：
試劑名稱（µL） | 空白管 | 測定管 | 標準管 |
蒸餾水 | 60 | - | - |
樣本 | - | 60 | - |
標準溶液 | - | - | 60 |
工作液 | 1000 | 1000 | 1000 |
充分混勻，37℃反應5min，測定546nm處吸光值A，分別記為A空白、A測定、A標準，計算ΔA測定= A測定-A空白，ΔA標準= A標準-A空白。空白管和標準曲線只需測定1-2次。 | |||
三、游離血紅蛋白（FHb）含量計算
1. 標準曲線的繪制：
根據標準管的濃度（x，mg/L）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，mg/L）。
2. FHb含量的計算：
游離血紅蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F
F：樣本稀釋倍數。
注意事項：
1. 若測定血漿樣本，采樣和分離血漿過程中避免發生溶血。
2. 若樣本測定管吸光值A測定＞1，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定。
3. 若樣本測定管吸光值A測定＜0.01或接近空白管吸光值，建議將樣本加樣量增大后再進行測定，空白管和標準管加樣量也需進行相應調整。
實驗實例：
1. 取60µL兔血清樣本，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A測定-A空白= 0.216-0.064= 0.152，根據標準曲線y=0.007x-0.0075，R2=0.9981。計算x=22.786，計算FHb含量得：
游離血紅蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F=22.786 mg/L。
2. 取60µL馬血清樣本，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A測定-A空白= 0.166-0.064= 0.102，根據標準曲線y=0.007x-0.0075，R2=0.9981。計算x=15.643，計算FHb含量得：
游離血紅蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F=15.643 mg/L。
參考文獻：
[1] Reeder B, Svistun enko D, Cooper C, et al. The radical and redox chemistry of myoglobin and hemoglobin: from in vitro studies to human pathology [J]. Antioxid Redox Signal, 2004, 6(6): 954-966.
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