甲基檸檬酸合酶（MCS）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5865

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑四：臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑五：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說(shuō)明：

甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰*A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸；該反應(yīng)促使DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸收峰，據(jù)此可以計(jì)算MCS活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）和10μL試劑一，進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液和10μL試劑一），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間5min）；然后12000 g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱15min。

3、 操作表：在微量比色皿/96孔板中依次加入（適用于測(cè)定動(dòng)物組織樣本）

4、 操作表：在微量比色皿/96孔板中分別加入（適用于測(cè)定微生物及植物組織樣本）

三、甲基檸檬酸合酶（MCS）計(jì)算公式

1. 使用96孔板測(cè)定（動(dòng)物組織樣本）：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V樣）÷T=700.28×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V樣）÷T=707.28×ΔA÷W

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，0.6cm；V反：反應(yīng)體系體積，0.2mL； V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.007mL；V提取：加入提取液及試劑一的體積，1.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

2. 使用96孔板測(cè)定（微生物及植物組織樣本）：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V樣）÷T=20.42×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V樣）÷T=20.63×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌/細(xì)胞計(jì)算：

酶活定義：每10⁶個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（N÷V提取×V樣）÷T = 20.63×ΔA÷N

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，0.6cm；V反：反應(yīng)體系體積，0.2mL； V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.040mL；V提取：加入提取液及試劑一的體積，1.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計(jì)。

3. 使用微量比色皿測(cè)定：

將上述公式中的d=0.6cm改為d=1cm（微量比色皿光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1. 測(cè)定過(guò)程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。

2. 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3. 由于提取液含有蛋白成分（約1mg/mL），故測(cè)定蛋白濃度時(shí)需要同時(shí)測(cè)定提取液的蛋白濃度。

4. 當(dāng)樣本ΔA＜0.01時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)酶促反應(yīng)時(shí)間或增大樣本量后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式。

5. 當(dāng)樣本ΔA>1或A>1.5時(shí)，可將樣本用提取液適當(dāng)稀釋后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.0918g小鼠心臟加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清用后，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.665-0.349）-（0.261-0.251）=0.306，按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）= 707.28×ΔA÷W =2357.60 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1186g霉菌加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.362-0.262）-（0.255-0.261）=0.106，按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）= 20.63×ΔA÷W =18.72 U/g 質(zhì)量。

3、 取0.1013g竹葉加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.291-0.252）-（0.261-0.249）=0.027，按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=20.63×ΔA÷W =5.50 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Maerker, C, et al. "Methylcitrate synthase from Aspergillus fumigatus. Propionyl-CoA affects polyketide synthesis, growth and morphology of conidia. " Febs Journal 272.14(2010):3615-3630.

[2] Watson, D., Lindel, D.L. & Fall, R. Pseudomonas aeruginosa contains an inducible methylcitrate synthase. Current Microbiology 8, 17–21 (1983).

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