蛋白質二硫鍵含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5795

規格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液配制：臨用前根據樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進行配制，勿一次性全部混合。

2、 若試劑二有析出，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。

3、 標準品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）。臨用前加入1.3mL蒸餾水配制成25μmol/mL，2-8℃保存4周。

4、 0.125μmol/mL標準品配制：取50μL 25μmol/mL標準品，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成1.25μmol/mL的標準品；然后取100μL 1.25μmol/mL標準品，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.125μmol/mL的標準品使用，現配現用。

產品說明：

蛋白質是一類重要的生物大分子，存在于一切生物體內，是生命的基礎物質。二硫鍵是連接不同肽鏈或同一肽鏈中，兩個不同半胱氨*殘基的巰基的化學鍵。二硫鍵對蛋白質的結構影響很大，在蛋白質分子中，起著穩定肽鏈空間結構的作用，所以測定蛋白質二硫鍵含量尤為重要。

還原劑會使二硫鍵裂解，裂解后的巰基會發生親核反應，即巰基與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰，據此可以計算蛋白質二硫鍵含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機、研缽/勻漿器、丙酮（AR）、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進行實驗,；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

2. 細菌/細胞：按照細菌/細胞數量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌/細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，總時間3min）后，于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進行實驗；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

3. 血清/血漿、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙酮，4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：若測定數值偏小，可改變樣本與丙酮的比例，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮，注意同步修改計算公式）。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至412nm，分光光度計蒸餾水調零。

2、 操作表：（建議在2mL的EP管中操作）

三、蛋白質二硫鍵含量的計算

1. 按照樣本蛋白濃度計算：

蛋白質二硫鍵含量（μmol/mg prot）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（V樣本×Cpr）÷2×F

=0.0625× ΔA測定÷ΔA標準×Cpr×F

2. 按照樣本質量計算：

蛋白質二硫鍵含量（μmol/g 質量）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷W÷2×F

=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F

3. 按照液體體積計算：

蛋白質二硫鍵含量（μmol/mL）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷V液樣÷2×F

=1.25×ΔA測定÷ΔA標準×F

4. 按照細胞/細菌數量計算：

蛋白質二硫鍵含量（μmol /10⁶ cell）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷N÷2×F
=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷N×F

C標準：標準管濃度，0.125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.3mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定，可以使用BCA方法測定；W：樣本質量，g；V試劑一：提取時加入試劑一體積，2mL；V液樣：提取時加入的樣本體積，0.1mL；2：一個二硫鍵裂解產生兩個巰基；F：稀釋倍數；N：細胞/細菌總數，以10⁶計。

注意事項：

1. 若樣本Δ測定A<0.01，可適當增大樣本量后測定，注意同步修改空白管和標準管及計算公式；若樣本ΔA測定>1.5，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測定，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數。

實驗實例：

1、 取100μL馬血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.348-0.113）-（0.047-0.045）=0.233，ΔA標準=A標準-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本液體體積計算蛋白質二硫鍵含量得：

蛋白質二硫鍵含量（μmol/mL）= 1.25×ΔA測定÷ΔA標準×F =0.933μmol/mL。

2、 取0.1036g鼠肝，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.475-0.107）-（0.261-0.105）=0.212，ΔA標準=A標準-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本質量計算蛋白質二硫鍵含量得：

蛋白質二硫鍵含量（μmol/g 質量）=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =0.820μmol/g 質量。

3、 取0.1078g黃豆粉，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2對照-A1對照）=（0.762-0.084）-（0.123-0.070）=0.625，ΔA標準=A標準-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本質量計算蛋白質二硫鍵含量得：

蛋白質二硫鍵含量（μmol/g 質量）=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =4.646μmol/g 質量。

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