碘乙酰胺

碘乙酰胺相關(guān)實(shí)驗(yàn)：

1蛋白質(zhì)的N端測(cè)序  Edman降解法：Edman降解進(jìn)行蛋白質(zhì)與多肽序列分析是一個(gè)循環(huán)式的化學(xué)反應(yīng)過程。包括三個(gè)主要的化學(xué)步驟：（1）偶聯(lián)：異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)和多肽的N-端殘基反應(yīng)；（2）環(huán)化裂解：苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解；（3）轉(zhuǎn)化：噻唑呤酮苯氨（ATZ）轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）；為了提高靈敏度，一是采用放射性同位素、熒光基團(tuán)或有色Edman試劑, 二是采用更靈敏的鑒定手段, 如用微量薄層層析、氣相色譜和高壓液相色譜檢出PTH氨基酸。蛋白質(zhì)的液相測(cè)序儀、固相測(cè)序儀和氣相測(cè)序儀的原理都是Edman降解法。此法不能用于N端封閉的蛋白質(zhì)的測(cè)序。

2蛋白質(zhì)的C端測(cè)序  

（1）羧肽酶法：羧肽酶法的原理就是通過檢測(cè)羧肽酶逐個(gè)釋放氨基酸的順序來判斷蛋白質(zhì)的C端序列。其中釋放氨基酸的檢測(cè)有兩種：（1）色譜法：直接檢測(cè)所釋放的氨基酸；（2）質(zhì)譜法：通過測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽原分子量和釋放一個(gè)氨基酸以后分子量的差值來推斷所釋放氨基酸種類，依次類推。羧肽酶法是近年來一種應(yīng)用廣泛的蛋白質(zhì)及多肽C端測(cè)序方法。羧肽酶有4種，即: 羧肽酶A（CPA）、羧肽酶B（CPB）、羧肽酶Y（CPY）和羧肽酶P（CPP）。其中常用的是CPY和CPP。  

（2）化學(xué)法：化學(xué)法指蛋白質(zhì)或多肽與化學(xué)試劑反應(yīng)后，專一性的裂解并檢測(cè)C端氨基酸的方法。主要有(異) 硫氰酸法和過氟酸酐法。

1、 (異)硫氰酸法的原理：(異)硫氰酸法又稱Schlack-Kumpf降解,該方法與Edman降解的原理類似.即化學(xué)試劑（異)硫氰酸）與蛋白或多肽的α-羧基反應(yīng)，形成蛋白質(zhì)或多肽乙內(nèi)酰硫脲,再用裂解試劑切下C端殘基,形成氨基酸乙內(nèi)酰酸脲,然后利用HPLC系統(tǒng)分離分析游離的氨基酸乙內(nèi)酰酸脲。由于不同氨基酸的乙內(nèi)酰酸脲在HPLC上的保留時(shí)間不同，因此可以區(qū)分各種氨基酸。C端測(cè)序儀的原理即(異) 硫氰酸法。

2、過氟酸酐法的原理：C端氨基酸殘基的α-羧基與混合酸酐反應(yīng)后，通過酮-烯醇轉(zhuǎn)換成氧氮雜環(huán)戊酮（惡唑酮），然后利用過氟酸或TFA，把這個(gè)環(huán)從C端截掉。然后反應(yīng)依次連續(xù)進(jìn)行。用質(zhì)譜測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的分子量，通過相鄰分子量的差值就可以得到其C端序列。  另外質(zhì)譜法在蛋白質(zhì)測(cè)序中發(fā)揮的作用越來越大。    

Edman降解（Edmandegradation）：是測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，主要是從蛋白質(zhì)或多肽氨基末端進(jìn)行分析。由埃德曼（P．Edman）在上世紀(jì)50年代所創(chuàng)立。分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個(gè)步驟。首先在pH9．0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的N一端*個(gè)肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物：隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH．氨基酸)；后以色譜法鑒定出降解下來的PTH．氨基酸種類，從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息。Edman降解法的優(yōu)點(diǎn)是異硫氰酸苯酯與所有氨基酸殘基的反應(yīng)產(chǎn)率和回收率都相當(dāng)高，因此反應(yīng)副產(chǎn)物少，用色譜可以準(zhǔn)確鑒定。而且對(duì)大多數(shù)氨基酸殘基而言，30 min的耦合反應(yīng)時(shí)間、5 min的切割反應(yīng)時(shí)間都已足夠。  DNS法及聚酰胺薄膜層析技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)N—末端和蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析  原理： DNS—Cl在堿性環(huán)境里蛋白質(zhì)和肽的α-氨基酸的氨基起反應(yīng)，生成帶有熒光的、穩(wěn)定的DNS-氨基酸  蛋白質(zhì)在水解前與DNS—Cl反應(yīng)，產(chǎn)生DNS-蛋白質(zhì)，它標(biāo)記在N-末端氨基酸殘基上，經(jīng)水解和薄層層析而測(cè)知是何種氨基酸。蛋白質(zhì)水解后與DNS—Cl反應(yīng)，標(biāo)記的是蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分，如圖19-1和圖19-2所示。這是一種較為簡(jiǎn)便的、適用的蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分分析的方法。（薄層層析：英文為thin layer chromatography 又稱薄層色譜，色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固—液吸附色譜，兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，因此，又可用來精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的質(zhì)。是將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、塑料片、金屬片等）上，形成薄層（常用厚度為0.25毫米左右）后，在此薄層上進(jìn)行層析分離的分析方法。

酶的不可逆抑制是指酶抑制劑與酶的活性中心發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)抑制劑共價(jià)地連接在酶分子的必需基團(tuán)上，阻礙了底物的結(jié)合或破壞了酶的催化基團(tuán)。這種抑制不能用透析或稀釋的方法使酶恢復(fù)活性。   通常將其分為非專一性不可逆抑制劑和專一性不可逆抑制劑。  抑制劑與酶分子上不同類型的基團(tuán)都能發(fā)生化學(xué)修飾反應(yīng)，這類抑制稱為非專一性的不可逆抑制。雖然缺乏基團(tuán)專一性，但在一定條件下，也有助于鑒別酶分子上的必需基團(tuán)。由于非專一性的不可逆抑制劑通常可作用于酶分子中的幾類基團(tuán)。但不同基團(tuán)與抑制劑的反應(yīng)性不同，故某一類基團(tuán)常首先或主要地受到修飾。如被修飾的基團(tuán)中包括必需基團(tuán)，則可導(dǎo)致酶的不可逆抑制。隨著蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的研究，目前已發(fā)現(xiàn)或合成了氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾劑。
這些化學(xué)試劑主要作用于某類特定的側(cè)鏈基團(tuán)，如氨基、巰基、胍基和酚基等。但絕大多數(shù)試劑都不是專一性的，可借副反應(yīng)而同時(shí)修飾其他類型的基團(tuán)。   專一性的不可逆抑制作用有KS型和Kcat型兩類。KS型不可逆抑制又稱親和標(biāo)記試劑，結(jié)構(gòu)與底物類似，但同時(shí)攜帶一個(gè)活潑的化學(xué)基團(tuán)，對(duì)酶分子必需基團(tuán)的某個(gè)側(cè)鏈進(jìn)行共價(jià)修飾，從而抑制活性。Kcat型不可逆抑制劑又稱酶的自殺性底物。這類抑制劑也是底物的類似物，但其結(jié)構(gòu)中潛在著一種活性基團(tuán)，在酶的作用下，潛在的化學(xué)活性基團(tuán)被激活，與酶的活性中心發(fā)生共價(jià)結(jié)合，不能再分解，酶因此失活。  

KS型不可逆抑制劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的： 1、它具有和底物類似的結(jié)構(gòu)， 2、可以和靶酶結(jié)合，  3、同時(shí)還帶有一個(gè)活潑的化學(xué)基團(tuán)可以和靶酶分子中的必需基團(tuán)起反應(yīng)， 4、該活潑化學(xué)基團(tuán)能對(duì)靶酶的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，從而抑制酶的活性。   鹵酮是使用早也是經(jīng)典的親和標(biāo)記試劑。其中以溴酮及氯酮較佳。例：胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是兩種專一性不同的內(nèi)肽酶，分別水解堿性氨基酸或芳香氨基酸的 羧基所形成的肽鍵，也可以分別水解這兩類氨基酸的酯類，但其氨基酸必須被阻斷而成非游離狀態(tài)。   Kcat型不可逆抑制劑即酶的自殺性底物，也是底物的類似物，但其結(jié)構(gòu)中潛在著一種活性基團(tuán)，在酶的作用下被激活，與酶的活性中心發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使酶失活。每一種自殺底物都是酶的作用對(duì)象，這是一種專一性很高的不可逆抑制劑。

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