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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC0070-50T/48S
更新時間：2024-04-24
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：2015
010-50973130
產品分類
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GU氨酸合成酶（GOGAT）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC0070
規(guī)格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
溶液的配制：
1、 工作液的配制：取試劑二、試劑三、試劑四各一支加入30 mL試劑一中溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，可分裝后-20℃保存，避免反復凍融。
產品說明：
GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非綠色組織的前質體中，和GU氨酰胺合成酶（GS）共同構成GS/GOGAT循環(huán)，參與氨同化的調控。
GOGAT以NADH為電子供體，催化GU氨酰胺的氨基轉移到α-酮戊二酸形成兩分子的GU氨酸，NADH在340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 工作液提前配置，平衡至室溫。
3、 樣本測定
試劑名稱（μL） | 測定管 |
工作液 | 900 |
樣本 | 100 |
混勻，加樣本的同時開始計時，在340 nm波長下記錄20秒時的初始吸光度A1，比色后迅速將比色皿連同反應液一起放入25℃水浴或培養(yǎng)箱中準確反應5分鐘；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，記錄5分20秒時的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。 |
三、GOGAT活性計算
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GOGAT活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr
（2）按樣本質量計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
GOGAT活性（U/g 質量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞數(shù)量計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
GOGAT活性（U/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.643×ΔA
V反總：反應體系總體積，10-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬；109：單位換算系數(shù)，1mol =109nmol。
注意事項：
1、測定期間樣本在冰上放置，以免變性和失活。
2、最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
3、當A1大于1.5或者ΔA大于0.6時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后測定，當ΔA過小時，可以延長酶促反應時間（10min或15min）或者加大加入的樣本體積進行測量。
4、由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。
實驗實例：
1、 取0.1g紅豆芽加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA= A1-A2=1.23-1.067=0.163，按樣本質量計算酶活得：
GOGAT活性（U/g 質量）=321.5×ΔA÷W=321.5×0.163÷0.1=524 U/g 質量。
2、 取0.1g稗草加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA= A1-A2=1.416-1.404=0.012，按樣本質量計算酶活得：
GOGAT活性（U/g 質量）=321.5×ΔA÷W=321.5×0.012÷0.1=38.58 U/g 質量。
相關發(fā)表文獻：
[1] Fei Ding,Qiannan Hu,Meiling Wang,et al. Knockout of SlSBPASE Suppresses Carbon Assimilation and Alters Nitrogen Metabolism in Tomato Plants. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)
[2] Jie Wang,Wei Zhou,Hui Chen,et al. Ammonium Nitrogen Tolerant Chlorella Strain Screening and Its Damaging Effects on Photosynthesis. Frontier in Immunology. January 2019;(IF4.259)
[3] Meng L, Li W, Zhang S, et al. Effects of sucrose amendment on ammonia assimilation during sewage sludge composting[J]. Bioresource technology, 2016, 210: 160-166.
參考文獻：
[1] del Pilar Cordovilla M, Pérez J, Ligero F, et al. Partial purification and characterization of NADH-glutamate synthase from faba bean (Vicia faba) root nodules[J]. Plant science, 2000, 150(2): 121-128.
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