葡萄糖含量檢測試劑盒(鄰甲苯胺顯色法)說明書

微量法

貨號：BC5875

規格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：取3.6mL試劑二、18mL冰乙酸加入試劑一混合，最后工作液為均一澄清液體。溶解好的試劑-20℃分裝避光可以保存8周。（注：若先將試劑一、試劑二混合，則溶液為無機相和水相的液體混合物，加入冰乙酸混勻后溶液會變均一澄清）

2、 標準品：臨用前加入1 mL 蒸餾水充分溶解，制備 10 mg/mL 葡萄糖標準溶液待用；用不完的試劑2-8℃保存4周。臨用前取30μL10mg/mL葡萄糖標準溶液，加入930μL蒸餾水，配制成0.3125mg/mL葡萄糖標準溶液。

產品說明：

葡萄糖不僅是細胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產生葡萄糖。就哺乳動物而言，葡萄糖不僅是大腦神經系統、肌肉、脂肪組織等的唯*能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關。

葡萄糖與鄰甲苯胺在強酸溶液中加熱，葡萄糖的醛基與鄰甲苯胺縮合成葡萄糖基胺，后者脫水生成席夫（Schiff）堿，呈現藍綠色，在630nm處有吸收峰。該試劑盒適合測定動物組織、血清（漿）及細胞（細菌）樣本。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、可調式移液槍、冰乙酸（98% AR）、5%三氯*酸（根據注意事項確定是否需要自備）、異丙醇（根據注意事項確定是否需要自備）、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 血清（漿）等液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。

2. 動物組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3. 細胞/細菌：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至630nm，可見分光光度計蒸餾水調零。

2．操作表：（在1.5mL EP管中加入下列試劑）

三、葡萄糖含量計算

1. 按樣本質量計算

葡萄糖含量（mg/mL）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V提÷W = 0.3125×ΔA測定÷ΔA標準÷W

2. 按樣本蛋白濃度計算

葡萄糖含量（mg/mg prot）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷(V樣×Cpr) =0.3125×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

3. 按液體體積計算

葡萄糖含量（mg/mL）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷V樣= 0.3125×ΔA測定÷ΔA標準

4. 按細胞數量計算

葡萄糖含量（mg/10⁴ cell）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V提÷N= 0.3125×ΔA測定÷ΔA標準÷N

C標：標準管濃度，0.3125mg/mL；V提：前處理提取液體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；N：細胞數量，以萬計。

注意事項：

1、 試劑一具有腐蝕性，請佩戴好手套口罩，小心操作。

2、 高血脂樣本若最終反應液出現渾濁，在反應液中加入550μL的異丙醇，充分混合，可以溶解脂質，消除渾濁，測定其吸光值。計算時將所測得吸光度乘以1.5。

3、 嚴重黃疸、溶血等血清樣本，需要先制備無蛋白血濾液（建議100μL樣本加300μL 5%三氯*酸溶液，充分混合，相當于將樣本稀釋四倍，3000rpm 4℃離心10min,取上清待測），再進行計算。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 取50μL人血清樣本，用蒸餾水稀釋5倍，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.450-0.057=0.393，ΔA標準=A標準-A空白=0.708-0.057=0.651，按液體體積計算得：

葡萄糖含量（mg/mL）=0.3125×ΔA測定÷ΔA標準×5 =0.943mg/mL。

2. 取0.1g小鼠肌肉組織，按前處理和測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.168-0.057= 0.111，ΔA標準=A標準-A空白=0.708-0.057=0.651，按液體體積計算得：

葡萄糖含量（mg/mL）=0.3125×ΔA測定÷ΔA標準÷W =0.533mg/mL。

參考文獻：

[1] Yee H Y, Goodwin J F. Evaluation of some factors influencing the o-toluidine reaction with glucose[J]. Analytical Chemistry, 2002, 45(13).DOI:10.1021/ac60335a030.

[2] Dubowski K M. An o-Toluidine Method for Body-Fluid Glucose Determination[J]. Clinical Chemistry, 1962(6) :6.DOI:10.1093/clinchem/8.6.592.

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