PCR純化Kit
貨號：D6492-01
規格：100/盒
品牌：omega

     聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增十萬乃百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

    PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性→退火→延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。重復循環變性→退火→延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

PCR反應體系：
    1、引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物濃度一般為0.1～0.5μM，這一引物濃度足以使1kb的DNA片段在PCR反應體系中循環擴增30T。以低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會，但濃度過低則得不到產物或產量過低。

    2、Taq酶：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，但保真度較差，在復制比較長的模板時容易發生點突變。另一種為在大腸桿菌合成的基因工程酶。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎，按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性，沒有校正功能。催化一典型的PCR反應約需酶用量一般為0.5～5U/100μl，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

    3、dNTP：dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系。多次凍融會使dNTP降解，一般存儲濃度為10mM，小量分裝，-20℃冷凍保存。在PCR反應中，dNTP濃度一般為50～200μM，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。高濃度dNTP可加速反應，但同時會增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度dNTP可提高PCR的性，但反應速度和PCR產物的產量會降低。dNTP能與Mg 2+ 結合，使游離的Mg 2+ 濃度降低。

    4、模板：就模板而言，影響PCR的主要指模板的數量和純度。一般PCR反應中模板的數量為10 2 ～10 5 個拷貝，靈敏的PCR甚可從一個細胞、一根頭發、一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。模板的純度一般要求不是很高，某些擴增實驗中甚將裂解液直接作為PCR模板。但模板中不能有影響擴增反應的物質存在，如蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA、卟啉類物質等，上述物質的存在會影響擴增效果，甚使擴增失敗。模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當稀釋模板。一般對于單拷貝的哺乳動物基因組模板來說，100ul的反應體系中有100ng的模板已足夠。

    5、Mg 2+ ：Mg 2+ 濃度對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響。一般PCR反應中，當dNTP濃度為200μM時，Mg 2+ 濃度為1.5～2.0mM為宜。Mg 2+ 濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，Mg 2+ 濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。此外，Mg 2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產物的解鏈溫度、產物的特異性、引物二聚體的生成等。

PCR反應條件：
    1、變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不*是導致PCR失敗的主要原因。一般情況下，93℃～94℃/min足以使模板DNA變性，若低于93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物*變性，就會導致PCR失敗。
    2、退火溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
   復性溫度=Tm值－(5～10℃)
   在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60秒，足以使引物與模板之間*結合。
    3、延伸溫度與時間：PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸15min。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
    4、循環次數：循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40T之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

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2、低溫產品：低溫產品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸。事先用冰袋把產品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴實密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
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