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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC4290-50T/24S
更新時間：2024-04-16
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：813
010-50973130
產品分類
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N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶（NAG）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC4290
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前取一瓶加入2.5 mL蒸餾水溶解備用；可-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
2、 標準品：5 μmol/mL *溶液。
產品說明：
N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.52，N-acetyl-β-D-glucosidase，NAG）廣泛分布于各種組織中，是一種細胞內溶體酶，測定NAG活性可用于腎小管間質性腎炎、尿路感染、糖尿病腎病綜合癥、高血壓腎病、腎移植后的排異反應和腎病綜合癥的早期診斷。
NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成對-硝 基*酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定400nm下吸光度的變化來計算NAG活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、天平、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、超聲破碎儀、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量（g）:提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取0.1g組織，加入1mL提取液），冰浴勻漿。15000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、細菌、細胞：先收集細胞或細菌樣本到離心管內，離心棄上清后，按照細胞數量104個：提取液體積（mL）500~1000:1的比例，建議500萬細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細胞（冰浴，功率200w，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后15000g，4℃，離心10min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）等液體：直接測定。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長至400nm，蒸餾水調零。
2、 標準溶液的稀釋：取125μL 5 μmol/mL對硝基 苯* 溶液，加入875μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.625 μmol/mL標準液使用，現用現配。（實驗中每管需要50μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）
3、 操作表 (在1.5mL離心管中依次加入下列試劑) ：
試劑名稱（µL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
試劑一 | 300 | 300 | 300 | 300 |
試劑二 | 150 | - | - | - |
蒸餾水 | - | 150 | 150 | 200 |
標準液 | - | - | 50 | - |
樣本 | 50 | 50 | - | - |
置于37℃水浴鍋或恒溫培養箱反應30min | - | - | ||
試劑三 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻后室溫放置2min，測定400nm的吸光度，分別記為A測定管、A對照管、A標準管、A空白管。計算ΔA測定=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管。標準管和空白管只需測1-2次。
三、NAG活性計算
1、按蛋白濃度計算
活力單位定義：每mg蛋白在反應體系中每分鐘生成1nmol對硝基 苯*定義為一個酶活力單位。
NAG (U/mg prot) =ΔA測定÷（ΔA標準÷C標）×1000×V樣÷（Cpr×V樣）÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
2、按樣本質量計算
活力單位定義：每g樣本在反應體系中每分鐘生成1nmol對硝基 苯*定義為一個酶活力單位。
NAG (U/g 質量)=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標）×1000×V樣÷(V樣÷V樣總×W)÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標準÷W
3、 按細胞數量計算
活力單位定義：每104個細胞在反應體系中每分鐘生成1nmol對硝基 苯*定義為一個酶活力單位。
NAG (U/104 cell)= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標）×1000×V樣÷（細胞數量×V樣÷V樣總）÷T
=20.83×ΔA測定÷ΔA標準÷細胞數量
4、按液體體積計算
活力單位定義：每毫升液體在反應體系中每分鐘催化生成1nmol對硝基 苯*為一個酶活力單位。
NAG (U/mL)= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標）×1000×V樣÷V樣÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標準
C標：標準溶液濃度：0.625μmol/mL；V樣：加入的樣本體積，0.05mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，30min；細胞數量：以萬計；W：樣本質量，g；1000：換算系數，1μmol=1000nmol。
注意事項：
吸光度若大于1.2時，建議將樣本用提取液稀釋后進行測定。
實驗實例：
1. 取0.1g大鼠脾臟組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。15000g，4℃離心10min，取上清稀釋5倍，按照測定步驟操作，測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.798-0.042=0.756，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.364-0.006=0.358，按樣本質量計算得：
NAG（U/g 質量）=20.83×ΔA測定÷ΔA標準÷W×5（稀釋倍數）=2199.3687 U/g 質量。
2. 取0.1g玉蘭，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。15000g，4℃離心10min，取上清，按照測定步驟操作，測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.543-0.120=0.423，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.364-0.006=0.358，按樣本質量計算得：
NAG（U/g 質量）=20.83×ΔA測定÷ΔA標準÷W=246.120 U/g 質量。
3. 取兔血清直接檢測，按照測定步驟操作，測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.542-0.348=0.194，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.364-0.006=0.358，按液體體積計算得：
NAG（U/mL）=20.83×ΔA測定÷ΔA標準=11.2878 U/mL。
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