纖維素（CLL）含量檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC4285
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液一：80%乙醇400 mL，即將320 mL無水乙醇和80 mL蒸餾水混合，自備。提供一個125 mL空瓶。

2. 標準品：10 mg葡萄糖。臨用前加入1 mL蒸餾水溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃保存兩周。

3. 工作液的配制：取一瓶試劑一中加入2.5 mL試劑二，充分混勻，如較難溶解，可充分震蕩或加熱攪拌；用不完的試劑可以2-8℃保存一周。

產品說明：
纖維素是由β-D-葡萄糖單元以 β-1,4-糖苷鍵連接而成的直鏈多聚體，通常與半纖維素、果膠及木質素結合在一起，是植物細胞壁的主要結構成分。以纖維素為原料的產品廣泛應用于食品、造紙、塑料、電工及科研器材等領域。纖維素在酸性條件下加熱能分解成β-D-葡萄糖。在強酸作用條件下利用與蒽酮顯色劑測定纖維素含量。

技術指標：
低檢出限：0.0037 mg/mL
線性范圍：0.00391-0.3 mg/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式低溫離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰盒、B酮、濃硫酸、無水乙醇、蒸餾水和EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
 

1. 細胞壁物質（CWM）的提取：

1. 稱取約0.3g（記為W1）樣本，加入1mL提取液一，室溫快速勻漿，90℃水浴20min，冷卻至室溫，6000g，25℃離心10min，棄上清。

2. 沉淀先后用1.5mL提取液一和B酮各洗兩遍（渦旋振蕩2min左右，6000g，25℃離心10min，棄上清即可），沉淀即為粗細胞壁。

3. 在粗細胞壁中加入1mL提取液二（去除淀粉）浸泡15小時，6000g，25℃離心10min，棄上清，將沉淀用蒸餾水清洗兩遍（渦旋振蕩2min左右，6000g，25℃離心10min，棄上清即可），之后干燥沉淀（60-100℃均可），得到細胞壁物質（CWM），稱重記為W2。

1. 纖維素的提取：

1. 稱取烘干的CWM約 5mg（記為W3），加入0.5mL蒸餾水充分勻漿，勻漿液轉移至EP管中，用蒸餾水定容至0.5mL。

2. 將定容后的勻漿液置于冰水混合物中，緩慢加入0.75mL濃硫酸，緩慢混勻，冰水浴中靜置30min。8000g，4℃離心10min，取上清液，用蒸餾水稀釋20倍后待測。

注意：1. 若樣本或者干燥后的沉淀質地堅硬，可以先研碎再進行后續步驟
2. 在提取纖維素的過程中，首先，置于冰水浴中的EP管需要固定，不要上下左右浮動，一方面保障自身安全，另一方面防止冰水混合物進入EP管造成試驗誤差；再者，加入濃硫酸時，建議槍頭伸入樣本液面以下，緩慢加入，防止液面沸騰及樣本碳化。
二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至620nm，分光光度計蒸餾水調零。

2. 將10mg/mL 標準液用蒸餾水稀釋為0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078、0.0039mg/mL的標準溶液備用。

3. 標準品稀釋表

實驗中每個標準管需150µL標準溶液。

1. 操作表 (在1.5 mL離心管中) ：

三、纖維素含量計算
1、標準曲線的繪制：
根據標準管的濃度（x，mg/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA（y，ΔA）帶入公式計算樣本濃度（x，mg/mL）
2、纖維素含量的計算：
（1）按樣本質量計算
纖維素（mg/g 質量）=x×V提取×20×（W2÷W3）÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1
（2）按樣本細胞壁物質（CWM）質量計算
纖維素（mg/g 干重）=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52x÷W3
1.11：是此法測得葡萄糖含量換算為纖維素含量的常數，即111 µg葡萄糖用蒽酮試劑顯色相當于100 µg纖維素蒽酮試劑所顯示的顏色；V提取：纖維素提取液體積，1.25 mL（0.5 mL蒸餾水+0.75 mL濃硫酸）；20：樣本稀釋倍數；W1：樣本質量，0.3 g；W2：樣本細胞壁物質（CWM）質量，g；W3，提取纖維素時稱取的細胞壁物質（CWM）質量，g。
注意事項：

1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。

2. 濃硫酸具有強腐蝕性，操作時各個步驟均需特別注意：纖維素提取在加入濃硫酸時，建議槍頭伸入樣本液面以下，緩慢加入，以防止液體飛濺燒傷；95℃水浴結束取出后需冷卻至室溫再打開EP管蓋，以防液體飛濺燒傷。

3. 由于試劑二揮發性強且具有刺激性氣味，建議在通風櫥中進行工作液的配制。

實驗實例：

1. 取0.3g康乃馨葉片樣本提取細胞壁物質（CWM）0.02g，稱取烘干的CWM約 5mg（記為W3），提取纖維素，取上清液，用蒸餾水稀釋20倍后進行檢測，用96孔板測得計算ΔA=A測定管-A空白管=0.538-0.061=0.477，標準曲線y=8.3536x+0.0388，計算x=0.05246，按樣本質量計算得：

纖維素（mg/g 質量）=22.52×x×W2÷W3÷W1=15.752 mg/g 質量。

1. 取0.3g黑麥草樣本提取細胞壁物質（CWM）0.04g，稱取烘干的CWM約 5mg（記為W3），提取纖維素，取上清液，用蒸餾水稀釋20倍后進行檢測，用96孔板測得計算ΔA=A測定管-A空白管=0.666-0.061=0.605，標準曲線y=8.3536x+0.0388，計算x=0.06778，按樣本質量計算得：

纖維素（mg/g 質量）=22.52×x×W2÷W3÷W1=40.704 mg/g 質量。
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