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莽草酸脫氫酶活性檢測試劑盒 微量法
產品簡介:

儲存條件
-20℃
莽草酸脫氫酶活性檢測試劑盒 微量法
有效期
6個月
單位

推薦
若使用96孔板測定,需使用96孔UV板,推薦貨號YA0602
英文名稱
Shikimic acid Dehydrogenase(SD) Activity Assay Kit
檢測方法
微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
規格
100T/96S

產品型號:BC4185-100T/96S

更新時間:2024-04-12

廠商性質:生產廠家

訪 問 量 :905

服務熱線

010-50973130

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產品介紹


莽草酸脫氫酶(SD)活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號: BC4185
規格: 100T/96S
產品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱規格保存條件
提取液液體100 mL×1瓶2-8℃保存
試劑一液體10 mL×1瓶2-8℃保存
試劑二粉劑×12-8℃保存
試劑三粉劑×1-20℃保存
溶液的配制:
  1. 提取液:內含不溶物,用前搖勻。

  2. 試劑二:臨用前加入5 mL蒸餾水溶解。

  3. 試劑三:臨用前每瓶加入10 mL蒸餾水溶解。

  4. 工作液的配制:根據用量按照試劑一:試劑二:試劑三為7:4:8的體積比例充分混勻,備用,用前25℃預熱15min。

產品說明:
莽草酸途徑是存在于植物和微生物中的一條重要的代謝途徑,莽草酸脫氫酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代謝途徑中催化第四步反應的關鍵酶。
莽草酸脫氫酶催化莽草酸和NADP產生NADPH,檢測340nm下的吸光值增加速率來表示SD活性。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、微量石英比色皿/96UV板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液(加入前搖勻))進行冰浴勻漿,然后,8000g4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
2、細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3、液體:直接檢測。
二、測定步驟
  1. 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,紫外分光光度計蒸餾水調零。

  2. 工作液25℃預熱10min以上。

  3. 操作表:在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑

試劑名稱空白管測定管
工作液(µL)190190
樣本(µL)
10
蒸餾水(µL)10
加入樣本即開始計時,充分混勻后于340nm處測定20s時的吸光值A15min20s時的吸光值A2,計算ΔA測定管=A2測定-A1測定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管(空白管只需做1-2次)。
三、SD酶活計算
A、按微量石英比色皿計算:
  1. 按蛋白濃度計算

酶活定義:每毫克蛋白每分鐘產生 1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
SD酶活(U/mg prot=ΔA÷ε×d×109×V反總÷V×Cpr÷T=643×ΔA÷Cpr
  1. 按樣本質量計算

酶活定義:每克樣本每分鐘產生1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
SD酶活(U/g 質量)=ΔA÷ε×d×109×V反總÷V×W÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W
  1. 按細胞數量計算

酶活定義:每104個細胞每分鐘產生1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
SD酶活(U/104 cell)=ΔA÷ε×d×109×V反總÷V÷V樣總×細胞數量(萬個))÷T
=643×ΔA÷細胞數量(萬個)
  1. 按液體體積計算

酶活定義:每mL液體樣本每分鐘產生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。
SD酶活(U/mL=ΔA÷ε×d×109×V反總÷V÷T=643×ΔA
εNADPH摩爾消光系數,6.22×103L/mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應體系總體積,2×10-4L;V樣:反應體系中樣本體積,0.01mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;T:反應時間,5min109:單位換算系數,1mol=109nmol;V樣總:加入提取液體積,1mL
B、按96UV板計算:
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm96孔板光徑)進行計算即可。

注意事項:
  1. 樣本提取上清液置于冰上待測,且樣本提取完成后建議2h內測完。

  2. 樣本的蛋白濃度需自行測定,由于提取液中含有一定濃度的蛋白(約1 mg/mL),所以測定樣本蛋白濃度時需扣除提取液自身蛋白濃度。

  3. ΔA大于1時,建議將樣本稀釋后再進行測定。當ΔA小于0.01時,可以延長反應時間(10min15min)來測定。

  4. 空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔,正常情況下,變化不超過0.01。

實驗實例:
  1. 取0.1g稗草,加入1mL提取液,進行樣本處理,取上清按照測得步驟操作,用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.2771-0.2433=0.0338,ΔA空白管=A2空白-A1空白=0,ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.0338,按照樣本質量計算得:SD酶活(U/g 質量)=643×ΔA÷W=217.334 U/g 質量。

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