檸檬酸（CA）含量檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2155
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑三：為易揮發試劑，用完后盡快密封，-20℃保存；

2. 試劑四：臨用前取1支加入1.5 mL試劑一，充分溶解，用不完的試劑2-8℃保存2周。

3. 標準品：2 μmol/mL檸檬酸標準液。

產品說明：
CA是生物體內常見的有機酸，是重要的食品風味物質。此外，CA是三羧酸循環第一步反應的產物。
酸性條件下，檸檬酸還原Cr⁶⁺生成Cr³⁺，在545nm處有特征吸收峰；通過測定545nm吸光值的增加，即可計算出樣本中檸檬酸含量。
技術指標：
低檢出限：0.04 μmol/mL
線性范圍：0.05-5 μmol/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液槍、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 液體樣本中檸檬酸提取：取0.1mL液體加試劑一0.9mL，充分混勻，11000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測。（若測定值較低，可適當調整液體樣本和試劑一的體積比例，如（0.2mL液體樣本+0.8mL試劑一）或（0.5mL液體樣本+0.5mL試劑一）。）

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。  

2. 細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3. 線粒體中檸檬酸提取：稱約0.1g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，600g，4℃離心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃離心10min，棄上清（此上清液可用于細胞質CA含量測定）；向沉淀中加試劑二200μL，以及試劑三2μL，充分懸浮溶解，11000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長到545nm，分光光度計蒸餾水調零。

2. 試劑一置于30℃水浴中預熱30min以上。

3. 操作表（按下表在1.5mLEP管/96孔板管中加入相應試劑）：

三、檸檬酸含量計算

1. 按液體體積計算：

檸檬酸含量（μmol/mL）= C標準液×ΔA測定÷ΔA標準×F= 20×ΔA測定÷ΔA標準

1. 按組織質量計算：

檸檬酸含量（μmol/g 質量）= C標準液×ΔA測定÷ΔA標準×V總÷W = 2×ΔA測定÷ΔA標準 ÷W

1. 按細胞/細菌數量計算：

檸檬酸含量（μmol/10⁴ cell）= C標準液×ΔA測定÷ΔA標準×V總÷N=2×ΔA測定÷ΔA標準÷N

1. 按蛋白濃度計算：

檸檬酸含量（μmol/mg prot）= C標準液×ΔA測定÷ΔA標準 ×V樣÷（Cpr×V樣）= 2×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
C標準液：標準品的濃度，2μmol/mL；F：樣本稀釋倍數，（0.1mL樣本+0.9mL試劑一）÷0.1mL樣本=10；V總：上清液總體積，1.0mL；W：樣本質量，g；N：細胞/細菌數量，以萬計；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需自行測定；V樣：加入的樣本體積，20μL=0.02 mL。
注意事項：
1、樣本處理等過程均需要在冰上進行。
2、試劑五為易致癌物質，實驗過程中，需佩戴手套，避免試劑五濺到皮膚上。
3、檸檬酸試劑一不能用于蛋白含量測定，如需測定蛋白含量，需另取組織進行測定。
4、若反應30min后有明顯的黑色小顆粒，屬于正常現象，需將樣本稀釋后再測。
5、如果樣本吸光值大于0.5（96孔板）或1.0（比色皿），建議將樣本用試劑一稀釋后進行測定。
實驗實例：

1. 取0.1065g竹子葉片加入1mL試劑一，冰上充分研磨，11000g 4℃離心10min，取上清液按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A空白管=0.185-0.109=0.076，ΔA標準=A標準管-A空白管= 0.292- 0.109=0.183，按樣本質量計算得：

檸檬酸含量（μmol/g 質量）=2×ΔA測定÷ΔA標準÷W =7.80 μmol/g 質量。

1. 取0.1094g兔腎臟組織加入1mL試劑一，冰上充分研磨，11000g 4℃離心10min，取上清液按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A空白管=0.270-0.109=0.161，ΔA標準=A標準管-A空白管= 0.292- 0.109= 0.183，按樣本質量計算得：

檸檬酸含量（μmol/g 質量）=2×ΔA測定÷ΔA標準 ÷W= 16.08 μmol/g 質量。

1. 取0.1mL小鼠血清加試劑一0.9mL，充分混勻，11000g 4℃離心10min，取上清液按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A空白管= 0.174-0.109=0.065，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.292-0.109 =0.183，按液體樣本的體積計算：

檸檬酸含量（μmol/mL）=20×ΔA測定÷ΔA標準=7.10 μmol /mL。
相關發表文獻：

1. Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al. Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease.March 2019;(IF5.959)

2. Luo M,Luo Y, Mao N,et al. Cancer-Associated Fibroblasts Accelerate Malignant Progression of Non-Small Cell Lung Cancer via Connexin 43-Formed Unidirectional Gap Junctional Intercellular Communication. Cellular Physiology and Biochemistry. November 2018;

3. Zhou Z, Duan Y, Zhou M. Carbendazim‐resistance associated β2‐tubulin substitutions increase deoxynivalenol biosynthesis by reducing the interaction between β2‐tubulin and IDH3 in Fusarium graminearum[J]. Environmental microbiology, 2019.

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