人骨髓單個核細胞分離液試劑盒
貨號：P5050
規格：3×100ml/kit
保存：室溫避光儲存，有效期少 2 年。

試劑盒內容：

全血及組織稀釋液 100ml
細胞洗滌液 100ml
試劑C 100ml
試劑E 100ml
試劑F 100ml
說明書 1 份

一、  各種動物骨髓細胞的采集方法
    1. 大鼠、小鼠骨髓的采集：用頸椎脫臼法處死動物，剝離出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F 液，沖洗出胸骨或股骨中全部骨髓液，以500g（約1800 轉/分）離心20 分鐘，棄上清。沉淀以F 液重復洗滌一次后用含20%胎牛血清的全血及組織稀釋液懸起（細胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個/ml），備用。
   2. 大動物骨髓的采集：
    A．骨髓穿刺點定位
   （1）胸骨：穿刺部位在胸骨中線,胸骨體與胸骨柄連接處，或選胸骨上1/3 部。
   （2）脛骨：穿刺部位在脛骨內側,脛骨上端的下方1 厘米處。
   （3）肋骨：穿刺部位在第5～7 肋骨各自的中點上。
   （4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3 厘米的髁嵴。
   （5）股骨：穿刺部位在股骨內側面,靠下端的凹面處。
 

B．骨髓穿刺方法
   （1）實驗動物按要求固定，穿刺部位去毛、消毒、麻醉，要求局部麻醉范圍直達骨膜，也可作全麻。
   （2）操作人員帶消毒手套，確定穿刺點，估計從皮膚到骨髓的距離并依此固定骨髓穿刺針長度。左手拇、食指繃緊穿刺點周圍皮膚，右手持穿刺針在穿刺點垂直進針，小弧度左右旋轉鉆入，當有落空感時表示針尖已進入骨髓腔。用左手固定穿刺針，右手抽出針芯，連接注射器緩慢抽吸骨髓組織，當注射器內抽到少許骨髓時立即停止抽吸，收集骨髓細胞加入4-5ml F 液混勻，以500g（約1800 轉/分）離心20 分鐘，棄上清，沉淀以F 液重復洗滌兩次后用含20%胎牛血清的全血及組織稀釋液懸起（細胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個/ml），備用。
   （3）左手壓住穿刺點周圍皮膚，迅速拔出穿刺針，用棉球壓迫數分鐘。如穿刺的是肋骨，除壓迫止血外，還需膠布封貼穿刺點，防止發生氣胸。
 

3. 人骨髓的采集：
   臨床方法收集骨髓細胞加入4-5ml F液混勻，以500g（約1800轉/分）離心20分鐘，棄上清，沉淀以F液重復洗滌兩次后用含20%胎牛血清的全血及組織稀釋液懸起（細胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個/ml），備用。

二、骨髓淋巴細胞分離方法
    1．取1ml 骨髓細胞懸液與E液按1:1比例混合再與1份全血及組織稀釋液混勻置20℃-30℃下自然沉降20-30分鐘。吸取渾濁的上清部分，棄去底部紅細胞備用。
    2. 取渾濁的上清部分液體小心疊加在C 液之液面上（比例為1：1），20℃±2℃，400g（約1500 轉/分），離心20 分鐘（半徑15cm 水平轉子）。
     此時離心管中由上下細胞分四層。*層;為稀釋液層。第二層；為環狀乳白色含所需單個核細胞層。
     第三層；為透明分離液層。第四層；為極少紅細胞層。收集第二層細胞放入含細胞洗滌液4-5 毫升的試管中，充分混勻后，以500g（約1800 轉/分）離心20 分鐘。沉淀經反復洗滌2 次即得所需單個核細胞。
    注： 提取率約為80%。
    分離圖例：

三、  注意事項
     A． 本分離液是敏光型的，在運輸和貯藏過程中應在18℃-25℃避光保存，啟封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于10℃ 以下易出現白色結晶，影響分離效果。
    B． 待分離的骨髓要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一定在20℃水浴箱中復溫20 分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果好，且所有操作過程一定要在無菌條件下進行。
    C． 由于各品牌離心機的性能不同，國內南北地區溫度環境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調節離心轉數，調節離心的時間，摸索的分離條件（具體分離條件各實驗室自定）。
    D． 好使用無靜電反應的離心管，推薦使用未經過堿處理的玻璃離心管。

四、產品性能指標

pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內毒素 ≤0.5EU/ml
無菌 直接接種培養14 天后培養基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每50ml 溶液中含10μm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25μm 以上的不溶性微粒5 粒以下

五、貯藏及保存期限
    18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置4℃保存，有效期一周。
    注：若保證無微生物污染，啟封后可置4℃長期保存。但應注意保存溫度較低時本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

人骨髓單個核細胞分離液試劑盒訂購說明：

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參考文獻：
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《High expression of PIM2 induces HSC proliferation in myelodysplastic syndromes via the IDH1/HIF1?α signaling pathway》 作者:Zhaoyun Liu, Mengyue Tian, Kai Ding ,Hui Liu, Yangyang Wang, Rong Fu 期刊:Oncol Lett. 影響因子:1.871 PMID:31186757