Western blotting（小鼠IgG） DAB法顯色試劑盒
 

貨號：
SW1010 Western blotting (小鼠 IgG)DAB 顯色試劑盒
SW1020 Western blotting (兔 IgG)DAB 顯色試劑盒
SW1030 Western blotting (山羊 IgG)DAB 顯色試劑盒
SW1040 Western blotting(小鼠/兔 IgG)DAB 顯色試劑盒

產品內容：
    1. 封閉試劑 30g。
    2. 10 倍濃縮抗體稀釋液  50ml。
    3. HRP 標記二抗，  0.5ml，效價 1：500-3000。
    4. 20 倍 DAB 濃縮顯色液，5mlA+5mlB。
 

保存：
    -20℃避光密閉保存，一年有效。若經常使用，可將封閉試劑，抗體稀釋液和 20 倍 DAB 顯色液 B 存放于2-8℃以方便使用。

產品簡介：
    SDS-PAGE電泳后，蛋白質按照分子量大小分離，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的第二抗體起反應，經過底物顯色以檢測電泳分離的特異性的蛋白。

    經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。Western blotting 檢測系統除需要過氧化物酶標記的各種二抗外，還需要配套的顯色試劑。索萊寶提供DAB顯色和ECL化學發光兩種試劑及相應試劑盒。

操作步驟：(僅供參考)
常規電泳轉膜后:
     1) 清洗轉印膜：將膜剝離下后，作好標記，一般在左上角剪一缺口。室溫用 TBS-T 漂洗 3 次每次 5min,以盡量洗去轉印膜上的 SDS，防止影響后面的抗體結合。
     2) 按 5g 封閉試劑加 100ml 雙蒸水計，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過的轉印膜，封閉液內，搖床震動，室溫封閉 30min。用 TBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次每次 5min。
     3) 將 10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成 1× （10ml 10×抗體稀釋液加入 90ml 雙蒸水， 混勻， 可 4℃保存三個月） 。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。
     4) 用 1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育或 37℃搖動孵育 2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標記，分開孵育。
     5) 用 TBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次每次 5min。
     6) 用稀釋好的抗體稀釋液稀釋抗體。根據用量，按 10ml 抗體稀釋液加入 10ul HRP 標記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃搖動孵育 1h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。
    7) 用 TBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次每次 10min。
    8) 配制 DAB 顯色：根據用量，取 TBS-T 4ml，加入 DAB 顯色液 A、DAB 顯色液 B 各 200ul，混勻，加在膜正面，室溫下顯色。在目標條帶顯出后，而且背景未出時，放入水中終止顯色。

注意事項：
    1. 請根據一抗來源選擇試劑盒。
    2. western blotting DAB 顯色法操作簡單， 但其敏感性與 ECL 發光發有一定的差距， 一般只適用于豐度較高的蛋白。
    3. 可以根據顯色結果來優化實驗反應時間。如背景過深，可延長膜封閉時間，加長終漂洗次數與時間。如果條帶過弱，可延長抗體孵育時間。
    4. 如果*沒有條帶，請檢查前期蛋白處理及實驗過程， 如果確認無誤，反復兩次依舊無結果，請換用 ECL發光法顯色。
    5. TBS-T（0.01M）配制方法：稱取 NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用 800ml 的雙蒸水溶解，用鹽酸調 PH 到 7.6，再加入 0.5ml Tween－20，用雙蒸水 加 1000ml，混勻即可。 （也可按照自己的配制習慣來配制）
 

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運輸說明：

1、極低溫產品：極低溫產品運輸過程中加裝干冰運輸。用干冰把產品包裹起來，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
2、低溫產品：低溫產品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸。事先用冰袋把產品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴實密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
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