細胞培養試劑 活性氧檢測試劑盒
貨號 ：CA1410
規格 ：100-500T

產品內容 ：

產品簡介 ：
    活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、 過氧化氫、 及其下游產物過氧化物和羥化物(O2? ? ,H2O2, ?OH, ONOO ? , ?NO)等，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。采用
2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用、靈敏的細胞內活性氧檢探針。DCFH-DA 沒有熒光，進入細胞后被酯酶水解為 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在時 DCFH 被氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質 dichlorofluorescein (DCF)，其熒光在激發波長 502 nm，發射波長 530 nm 附近有大波峰，強度與細胞內活性氧水平成正比。此活性氧檢測系統本底低，靈敏度高，重復性好，操作簡便。
本試劑盒適于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等圖像檢測，熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀定量 ROS 檢測。

作波長：
適宜激發波長 500、485 (500 ± 15 nm)，適宜發射波長 525 (530 ± 20 nm)。也可按照 FITC 熒光檢測條件檢測。

操作步驟 ：
一 、 試劑準備 ：
    1. DCFH-DA 可稀釋于培養基或緩沖液中。 血清或培養基顏色并不影響 DCFH-DA 及細胞內熒光產生， 但可能會影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀熒光測定。可將 DCFH-DA 稀釋于無酚紅培養基或適宜的緩沖液如 PBS 中。這依賴于使用何種熒光設備進行測定。
    2. 加入 DCFH-DA 的時機或孵育時間，以終能順利檢測細胞內活性氧為目的。藥物處理時間較短(<2小時)或預計 ROS 效應較弱，可先加或同時加入 DCFH-DA。反之，treat 刺激時間較長(>6 小時)或預計產生ROS 效應較強，可后加 DCFH-DA。
    3. 活性氧供體含高純度 12 mM H2O2。加入細胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過程中可產生其它類型的活性氧，均可使 DCFH-DA 氧化為 DCF 呈現強綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測試實驗系統或儀器的陽性試劑，以初步觀察細胞活性氧所產生的熒光的一般特征，并且也可以將該實際作為實驗的一個陽性對照。推薦該試劑的細胞工作濃度為 20~100 µM 或更低濃度，但超過 200µM 將產生細胞毒。如果用戶熟悉 ROS 熒光或實驗沒有必要采用陽性對照，可以不加該試劑。
二 、 加入熒光探針 ：
    1. 加入 DCFH-DA 于培養基，推薦初始工作濃度為 10 µM。對不同的細胞和處理，DCFH-DA 工作濃度可為 100 nM~20 µM，需進行預實驗確定合適的濃度。總體稀釋倍數應在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 對細胞的影響。以 DMSO 作為溶劑對照。
    2. 37 ºC 孵育細胞 30min~幾個小時，通常 30-60min 即可。孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DCFH-DA 濃度有關。
    3. PBS 洗滌細胞 2 次。
三 、 熒光檢測
    采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡圖像檢測照相，綠色熒光強度代表活性氧水平。也可進行微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate reader)實時或每 10 分鐘分時逐點檢測熒光強弱。對于流式細胞儀可將細胞用胰酶消化 PBS 洗滌后重懸檢測。

相關文獻：

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《Medicinal supplement genipin induces p53 and Bax?dependent apoptosis in colon cancer cells》 作者:Jingwang Ye, Jing Li, Xiangfeng Wang, Ling Li 期刊:Oncology Letters 影響因子:1.871 PMID:30127884
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