免疫染色實驗方法和步驟

免疫染色(immunol staining)包括免疫熒光(immunol fluorescence)、免疫組化(immunol histochemistry)、免疫細胞化學(immunol cytochemistry)等，可以參考如下步驟進行操作。 

1. 樣品準備(Sample preparation) 

對于貼壁細胞： 

可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培養細胞，然后到預定時間時進行固定等后續操作。  也可以用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的鑷子放置到6孔板內，然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養液洗去殘留的乙醇。這時就可以種入細胞進行培養，待細胞貼在蓋玻片上生長良好后，即可進行固定等后續操作。 

對于懸浮細胞： 

把細胞先在固定液中固定，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續操作。如果細胞的粘附能力不佳，可以在載玻片上用PDL等物質進行處理，以增強載玻片的粘附能力。 

對于冷凍切片： 

切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續操作。 

對于石蠟切片： 

脫蠟：切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，再換用新鮮的二甲苯脫蠟，共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘，兩次。90%乙醇5分鐘，兩 次，70％乙醇5分鐘，一次。蒸餾水5分鐘，兩次。 

抗原修復：根據不同的抗原和抗體，可以選擇把切片放置在如下抗原修復液中，10mM檸檬酸鈉，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加熱12分鐘，大約在30分鐘內緩慢冷卻室溫。 

2. 固定
可以使用適當的固定液固定細胞或切片，例如碧云天生產的免疫染色固定液(P0098)。固定完畢后，可以用免疫染色洗滌液(P0106)洗滌兩次，每次5分鐘。 
3. 封閉(Blocking) 

加入免疫染色封閉液(P0102)，封閉60分鐘。如果背景較高，可以4℃封閉。 

從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產生較高的背景。 

在整個免疫染色過程中我們推薦使用碧云天的側擺搖床(ESHK02)，側向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋樣品。如果樣 品比較容易脫落，也可以把所有的步驟放置在桌面上靜止進行，即封閉、抗體孵育、洗滌等步驟均不需搖動，但靜止操作時宜適當延長作用時間或次數。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 

參考一抗的說明書，按照適當比例用免疫染色一抗稀釋液(P0103)稀釋一抗。 

用微型臺式真空泵(EVAC06/EVAC07)吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果 一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育。 

回收一抗。加入免疫染色洗滌液， 在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。 

如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 

參考二抗的說明書，按照適當比例用免疫熒光染色二抗稀釋液(P0108)稀釋熒光標記的二抗，或者用免疫染色(非熒光)二抗稀釋液(P0110)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或堿性磷酸酯酶(AP)標記的二抗。辣根過氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天訂購。 

用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 

回收二抗。加入免疫染色洗滌液， 在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。 如果結果背景較高，可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。 
6. 蛋白檢測(Detection of proteins) 

對于免疫熒光染色，此時已經可以直接到熒光顯微鏡下觀察。 

對于非免疫熒光染色可以選用DAB等適當的顯色底物，或AB檢測體系等進行后續檢測。 
7. 多重染色(Multiple staining) 

如果進行的是免疫熒光染色，通常都可以進行多重染色。對于可以產生有色沉淀物的染色反應，例如DAB染色，一般不適合再進行多重染色。

多重熒光染色： 

可使用紅色熒光、綠色熒光和藍色熒光進行三重熒光染色。例如用免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3(P0193)進行紅色熒光染色，隨后可以用免疫熒光染色試劑盒-抗兔FITC(P0186)進行綠色熒光染色，在完成上述兩種染色后可以使用Hoechst染色試劑盒(C0003)對細胞核進行染色，染色后為藍色熒光。 

用HE染色進行復染： 
 

免疫熒光染色后可以用蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105)進行HE染色。