細(xì)胞發(fā)生衰老的表征變化

細(xì)胞，又稱“萬(wàn)能細(xì)胞"，是一種未充分分化、尚不成熟的細(xì)胞，在適當(dāng)條件下，具有再生各種組織、器官的潛能，因此被寄予厚望，干細(xì)胞研究也多次進(jìn)入國(guó)自然研究熱點(diǎn)排行榜前列。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有多向分化的潛能，體外在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞，2006年國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）確定此三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)是MSC鑒定的必檢項(xiàng)目，MSC的三系誘導(dǎo)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域一直深受各位科研人員的青睞和應(yīng)用。

如何構(gòu)建細(xì)胞衰老模型？

可引起細(xì)胞衰老的因素有很多，我們主要介紹一下目前常見的兩種細(xì)胞衰老模型構(gòu)建方式，一種為D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型，另一種為雙氧水誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型。D-半乳糖誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型為通過(guò)加入一定濃度的D-半乳糖引起自由基損傷，從而導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)，最后造成細(xì)胞衰老；雙氧水誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型為過(guò)氧化氫作為氧化劑可造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激使其代謝失調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老。  
     

半乳糖誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型建立     
    

1. 細(xì)胞培養(yǎng)      

選擇合適的細(xì)胞系，如人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）、小鼠成纖維細(xì)胞（L929）等。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，使用適宜的培養(yǎng)基，如含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

    
2. D -半乳糖溶液配制      

稱取適量的 D-半乳糖，用無(wú)菌 PBS 或培養(yǎng)基溶解，配制成所需濃度的溶液。一般常用的濃度范圍在10-100mmol/L 之間，具體濃度可根據(jù)不同細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行優(yōu)化。例如，對(duì)于HELF細(xì)胞，可嘗試50mmol/L的D-半乳糖溶液。溶液需經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩? 

  
3. 誘導(dǎo)處理      

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度（如80% - 90%匯合度）時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2 - 3次。然后加入含D -半乳糖的培養(yǎng)基，使 D-半乳糖終濃度達(dá)到設(shè)定值。將細(xì)胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間通常為7- 14天。在誘導(dǎo)過(guò)程中，需定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并更換含D-半乳糖的培養(yǎng)基，一般每2 - 3天更換一次。     

4. 模型鑒定      

細(xì)胞形態(tài)觀察：衰老細(xì)胞通常會(huì)出現(xiàn)體積增大、扁平，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多等形態(tài)變化。可通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。 染色檢測(cè)：衰老相關(guān)β -半乳糖苷酶（SA - β - Gal）染色：這是鑒定細(xì)胞衰老的經(jīng)典方法。衰老細(xì)胞內(nèi)的 SA - β - Gal 活性升高，在 pH 6.0 的條件下可將X - Gal底物水解成藍(lán)色產(chǎn)物。通過(guò)染色后在顯微鏡下觀察，計(jì)算藍(lán)色染色細(xì)胞的比例，若比例明顯高于對(duì)照組，則表明細(xì)胞衰老模型建立成功。     
   （僅供參考）      
     

雙氧水誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型建立     
    
  
 1. 細(xì)胞培養(yǎng)      

選擇合適的細(xì)胞系，如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH - SY5Y）等。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，使用對(duì)應(yīng)的適宜培養(yǎng)基，如含10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。    

2. 過(guò)氧化氫溶液配制      

一般來(lái)說(shuō)，H?O?溶液的工作濃度在 50 - 200μmol/L 之間，具體濃度需根據(jù)不同細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行優(yōu)化。例如，對(duì)于HUVECs細(xì)胞，可先嘗試 100μmol/L 的 H?O?溶液。由于H?O?不穩(wěn)定，易分解，所以需要用新鮮的PBS或培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用。     

3. 誘導(dǎo)處理      

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度（如70% - 80%匯合度）時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2 - 3次。然后加入含 H?O?的培養(yǎng)基，使 H?O?終濃度達(dá)到設(shè)定值。將細(xì)胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間通常為24 - 72小時(shí)。在誘導(dǎo)過(guò)程中，需密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，避免細(xì)胞因 H?O?濃度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而死亡。 

4. 模型鑒定      

細(xì)胞形態(tài)觀察：衰老細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)體積增大、形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞膜皺縮等變化。可通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。 染色檢測(cè)：同 D - 半乳糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老模型鑒定方法，衰老細(xì)胞內(nèi)的 SA - β - Gal 活性升高，染色后在顯微鏡下觀察，計(jì)算藍(lán)色染色細(xì)胞的比例，若比例明顯高于對(duì)照組，則表明細(xì)胞衰老模型建立成功。     
   （僅供參考）

染色結(jié)果： β-半乳糖苷酶陽(yáng)性部位著藍(lán)色至藍(lán)綠色 （hela cell）