1、膽固醇對蛋白冠形成的影響

2、膽固醇調節蛋白冠的蛋白質組指紋圖譜

為了獲得有關在胎牛血清中的SNP上形成的Nor-PC和Cho-PC的蛋白質指紋圖譜的信息，進行了蛋白質組分析（擴展數據圖3b）。結果表明，血清中的高水平膽固醇可以豐富載脂蛋白并減少NP上PC中的補體蛋白。

PC的形成遵循“Vroman效應"，即早期吸附的高豐度蛋白質將被具有更高親和力的蛋白質競爭性取代。接下來通過微尺度熱泳(MST)測量了這兩種蛋白與有或沒有膽固醇的SNP的結合親和力（圖2e）。表明，膽固醇可以通過差異調節結合蛋白的親和力來重塑PC中的蛋白質豐度。然后，進行了分子動力學模擬，以探索在存在和不存在膽固醇的情況下APOE和SNP之間的相互作用。結果表明，膽固醇-蛋白質和膽固醇-NP相互作用有助于重塑Cho-PC組成的結論。

3、膽固醇-蛋白冠增加巨噬細胞對納米顆粒的免疫反應

由于PC已被廣泛認為是NP的生物學特性，于是探討了Cho-PC對NP體外和體內行為的影響。由于游離膽固醇和膽固醇預處理的NP都不能增加免疫反應（圖3e，f），因此對NP的免疫反應增加主要受到PC中膽固醇介導的變化的影響。然后，進行蛋白質組分析，以鑒定與SNPs-Cho-PC和SNPs-Nor-PC孵育后巨噬細胞中差異表達的蛋白質。與對照組相比，SNPs-Nor-PC治療組中鑒定出788個下調蛋白和785個上調蛋白（擴展數據圖7c）。盡管Nor-PC和Cho-PC都激活了巨噬細胞的免疫反應，但Cho-PC引發了更強的反應。通過炎癥相關通路的基因集變異分析(GSVA)評分，發現了一致的變化（圖3i）。這些結果表明，Cho-PC可能比Nor-PC更大程度地增加免疫系統響應NP的激活風險。

4、Cho-PC增強肝細胞對NP的細胞攝取

由于細胞攝取對于納米藥物的藥代動力學和靶向效率至關重要，并且藥物通常由肝細胞代謝，進一步研究Cho-PC是否可能影響肝細胞中NP的細胞內化。使用HepG2細胞作為人肝細胞的體外模型，首先評估了AuNP（擴展數據圖8a）和SNP（擴展數據圖8b）的細胞毒性，發現HepG2細胞內有更多的AuNPs-Cho-PC積累（圖4f，g）。電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)分析發現，Cho-PC組中檢測到的Au多于Nor-PC組（圖4h）。由于向培養基中添加膽固醇會抑制NP內化（擴展數據圖8d-g），因此細胞對NP的攝取增強可能應歸因于膽固醇誘導的Cho-PC的特定蛋白質成分，而不是膽固醇本身。

為了進一步研究Cho-PC誘導的NPs增強細胞攝取所需的關鍵因素，檢測在不同類型的內吞作用抑制劑存在下NPs的內化（圖4i-k和擴展數據圖8h-m）。結果表明，膽固醇和肌動蛋白驅動的機制有助于增強對高膽固醇血清中形成的冠-納米顆粒復合物的攝取。由于攝取所需的細胞表面受體在PC介導的細胞攝取NPs中的既定作用，測試了低密度脂蛋白受體(LDLR)和B型清道夫受體1型(SR-B1)是否參與。在競爭測定中，細胞預先與LDL和HDL預孵育以阻斷LDLR和SR-B1，并使用牛血清白蛋白(BSA)孵育作為對照。盡管預孵育在一定程度上抑制了SNPs-Nor-PC和SNPs-Cho-PC的攝取，但只有LDL和HDL對SNPs-Cho-PC的攝取具有比對SNPs-Nor-PC更明顯的抑制作用（圖4l）。因此，LDLR和SR-B1可能參與脂蛋白介導的內化增強。

5、高膽固醇血癥小鼠體內納米顆粒的生物分布

Cho-PC是否可以改變NP的體內生物分布，通過高膽固醇飲食喂養小鼠15周建立高膽固醇血癥小鼠模型（圖5a）。詳細分析發現，與FBS和人血清中的結果相比，PC的蛋白質組成發生了類似的變化（圖5c、d和擴展數據圖9）。因此，血清膽固醇差異水平對PC制劑的調節也可以在小鼠高膽固醇血癥模型中重現，與人血清結果一致。接下來，比較了從正常小鼠和高膽固醇血癥小鼠收集的血液和組織中AuNP的體內生物分布（擴展數據圖10a、b）。1小時后，在高膽固醇血癥小鼠中觀察到肝臟中鋅和銅水平增加。當24小時時，肝臟中的差異消失，但睪丸、腸、腎和脾中出現差異，這表明某些金屬元素的分布可能受到健康狀態依賴性靜脈注射納米藥物方式的影響。研究結果表明，當對健康和高膽固醇血癥個體進行靜脈注射時，基于納米粒子的納米藥物可能會出現不同的體內命運，例如生物相容性和生物分布，這為精密納米醫學提供了重要的見解（圖6）。用熒光標記的衍生物測量了SNP的體內分布，結果表明，高膽固醇血癥會影響納米粒子的體內生物分布。