IHC是一項具有挑戰性的應用技術，應用過程中常出現各種問題，例如檢測結果陰性，非特異性染色，染色強度不夠，著色不均，脫片，干片等。因此索萊寶為大家總結了一些IHC常見問題及處理方法，來幫助您改進IHC檢測，減少您的實驗優化過程，快速達到預期結果。

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a）甲醛：甲醛是保留組織和細胞內蛋白靶點的常用固定劑，是大多數IHC/ICC應用的良好選擇，但并不是一種通用的固定劑。醛的過度固定會修飾氨基酸（屬于表位中的一部分），并阻斷抗體與之結合。然而大部分情況下，利用抗原修復技術可暴露表位，以還原抗體結合。研究表明甲醛會誘導磷酸化依賴表位的細胞內轉位，從細胞膜轉移至細胞質。在這種情況下，冰預冷的無水甲醇或無水乙醇是適當的替代。

b）醇類：常用于細胞和組織固定的醇類是甲醇和乙醇。通常認為醇類不像甲醛固定劑那樣保留組織形態，不像甲醛那樣滲透，主要用于固定冰凍組織切片和細胞。在醇類固定之后不推薦進行抗原修復。

c）丙酮：丙酮是一種強的脫水劑，能引起組織蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷凍組織的切片。

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a）培養細胞：培養細胞的固定時間與組織相比較短，且固定液的濃度更低。例如，用2%甲醛溶液在室溫下固定20min，足以保留細胞形態和抗原性。

培養細胞的固定通常只是去除培養基，并加入固定液即可。不過，去除培養基后表面張力的變化可能損害某些細胞類型。如果是這種情況，固定劑可直接加入培養基中。例如，加入與培養基相同體積的4%甲醛，將得到2%甲醛溶液，它足以預固定細胞。2min后，預固定培養基應當替換成新鮮的2%固定劑。預固定步驟讓細胞更加堅硬，這樣它們就能夠承受表面張力改變所引起的任何可能的有害影響。

b）組織：對于小組織來說，浸入固定溶液通常能獲得足夠的固定。可將解剖的組織浸潤在固定劑中，但是如果將固定溶液經由內循環系統（無論是通過心臟或通過腹主動脈）灌注，則往往能獲得更快速、更均勻的固定。在研究小動物的完整組織時，灌注固定是保留抗原的方法，包括用固定液來取代動物的全身血液。4%甲醛是組織灌注和浸潤固定的常用溶液。

為了在浸潤固定過程中加強固定劑的滲透，建議組織厚度不超過5mm。對于完整的固定，固定劑的體積應當是組織體積的50-100倍。固定通常在室溫下進行4-24小時。由于固定不足或固定過度可能降低或破壞組織的免疫反應性，因此優化條件很重要。

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由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇，通過抗原修復，使得細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方式一般分三種：高壓修復、微波修復、酶修復。

a）高壓修復是目前使用較多、較穩定、可重復性較高的一種方法，操作簡單，效果較好。但這種方法對修復的溫度和時間要求十分嚴格。我們常用的高壓鍋修復，溫度在110℃左右，修復時間為2.5min。

b）微波修復是較早采用的熱抗原修復技術，其方法受環境因素影響較大。微波修復偶爾也會出現同時修復的組織切片中以及同一切片的不同部位可能會出現修復效果不均勻的現象。比較適合高pH值的抗原修復液（EDTA、EGTA）修復。

c）酶修復法比較溫和，常用于脫片現象較嚴重的切片（如骨組織切片）。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。酶消化法進行抗原修復，須嚴格控制濃度和作用時間，消化不足，不能充分暴露出組織抗原；過度的消化會破壞組織結構，陽性定位不明確。我們常用蛋白酶K修復，條件為37℃ 10min。

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內源性過氧化物酶會與基質溶液（過氧化氫和顯色劑，例如DAB）發生反應，導致假陽性。在與HRP偶聯抗體一起孵育之前，先用過氧化氫預處理樣本可以顯著降低這種非特異性背景。滅活內源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫孵育10min左右。

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